组蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

组蛋白提取试剂盒提供了一种简单而应用广泛的方法以及相应的试剂提取总组蛋白。提取产物可用于组蛋白修饰实验比如乙酰化、甲基化、sumoylation。本试剂盒可以从哺乳动物细胞和组织样品中提取组蛋白，过程不超过60分钟，是目前市场上最快的组蛋白提取试剂盒。本试剂盒尤其为满足各种EpiQuik分析实验中要用到的组蛋白提取物而设计。组蛋白提取产物的产量接近0.4 mg每107个细胞或100 mg组织，不同的细胞和组织中，产量差异可能会很大。

组蛋白提取试剂盒

在生物学中组蛋白是染色质的主要蛋白组分。组蛋白像线轴，DNA缠绕在它的周围，且在基因调控中起着重要作用。核心组蛋白包括H2A,H2B,H3和H4。组蛋白的翻译后修饰可改变DNA与核蛋白之间的相互作用。H3和H4组蛋白有一个从核小体里伸出的长的尾巴，它在不同的位点（比如甲基化，乙酰化，磷酸化等）被共价修饰。组蛋白修饰参与多种生物过程比如基因调控，DNA修复和染色质凝集（有丝分裂）。组蛋白的各种修饰的结合构成了“组蛋白密码”，理解和掌握此密码将有益于回答基因调控机理和相关疾病的问题，因此，组蛋白相关研究成为了科研领域中炙手可热的存在。

组织组蛋白提取：

1.提取液制备：每500ul蛋白提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物混匀后置冰上备用。

2.取100mg组织样本剪碎，加入蛋白提取液A，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

3.将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，16000g条件下离心15分钟，弃上清。

4.沉淀中加入100ul组蛋白提取液B。

5.用200ul枪头反复吹打混匀或充分涡旋振荡混匀，置4℃冰箱过夜存放。

6.16000g条件下离心10分钟，收集上清。

7.在上清中加入25ul试剂C充分混匀。

8.加入上样缓冲液混匀后煮沸，分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

应用^[4][5]

用于桥本甲状腺炎患者的组蛋白甲基化及与碘的机制研究

从全基因组和整体蛋白水平探讨HT患者甲状腺细胞以及甲状腺组织组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）的变化,同时分析了高碘对甲状腺细胞H3K4me3和组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）的影响及在HT中的可能机制探讨。

方法:1)HT患者甲状腺细胞和组织H3K4me3变化:利用免疫共沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation and Deep Sequencing,chip-seq）分析了HT患者和对照组（3HT vs 3Control）原代培养甲状腺细胞全基因组内H3K4me3的分布特征,分析转录起始位点（TSSs）H3K4me3的差异富集位点,KEGG和GO分析相关基因的生物功能和富集通路,RT-PCR验证H3K4me3富集增加的重要基因（8HT vs 8 Control）的转录水平。Western blotting（WB）检测原代培养甲状腺细胞（4HT vs 4 Control）和甲状腺组织（6HT vs 6 Control）H3K4me3的整体蛋白水平,RT-PCR筛选甲状腺组织异常表达的组蛋白甲基化转移酶（30HT vs 30 Control）,免疫组化和Western blotting验证甲状腺组织组蛋白甲基化转移酶MLL1的蛋白表达。

2) 碘对甲状腺细胞组蛋白甲基化的影响:分别以10-3M和10-6M碘化钠刺激正常人甲状腺细胞系（N-Thy-ori-3-1）6小时和24小时,免疫共沉淀测序（chip-seq）分析了甲状腺细胞系在不同浓度高碘刺激不同时间后H3K4me3和H3K27me3全基因内的分布特征和差异富集位点,分析转录起始位点H3K4me3或H3K27me3显著差异富集的位点,Real Time PCR（RT-PCR）和Western blotting验证组蛋白去甲基化转移酶JMJD3的表达水平。高碘刺激甲状腺细胞系和HT患者原代培养细胞,RT-PCR筛选可能异常表达的组蛋白甲基化转移酶。梯度浓度高碘刺激甲状腺细胞系6和24小时后,Western blotting分析H3K4me3和H3K27me3整体蛋白水平,免疫荧光分析甲基转移酶的细胞定位,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测高碘刺激下H3K4整体甲基化水平。

3)JMJD3抑制剂GSK-J4的体外研究:高碘分别刺激HT患者和对照组甲状腺原代细胞以及正常甲状腺细胞系,PCR检测CCL2,CXCL10的表达;免疫组化和PCR检测HT患者甲状腺组织JMJD3,CCL2,CXCL10的表达。分别以高碘、TNF-α、以及高碘和TNF-α共同刺激甲状腺细胞,RT-PCR检验CCL2,CXCL10的转录表达;甲状腺细胞系在TNF-α作用下,分别加入JMJD3抑制剂GSK-J4和MLL1抑制剂MM102,RT-PCR和Western blotting检验CCL2,CXCL10的表达,Western blot检验细胞H3K27me3整体蛋白水平变化。流式细胞术检测甲状腺细胞氧化应激水平和凋亡。

参考文献

[1]Autoimmune thyroid disease during pregnancy[J].Simone De Leo,Elizabeth N Pearce.The Lancet Diabetes＆Endocrinology.2018(7)

[2]Role of iodide metabolism in physiology and cancer[J].Antonio De la Vieja,Pilar Santisteban.Endocrine Related Cancer.2018(4)

[3]Lysine demethylase inhibition protects pancreaticβcells from apoptosis and improvesβ-cell function[J].Marie Balslev Backe,Jan Legaard Andersson,Karl Bacos,Dan Ploug Christensen,Jakob Bondo Hansen,Jerzy Jòzef Dorosz,Michael Gajhede,Tina Dahlby,Madhusudhan Bysani,Line Hyltoft Kristensen,Charlotte Ling,Lars Olsen,Thomas Mandrup-Poulsen.Molecular and Cellular Endocrinology.2018

[4]Epigenetics:A way to bridge the gap between biological fields[J].Antonine Nicoglou,Francesca Merlin.Studies in History and Philosophy of Biol＆Biome.2017

[5]路晰媗.桥本甲状腺炎患者的组蛋白甲基化及与碘的机制研究[D].中国医科大学,2019.