快速DNA提取扩增试剂盒的应用

背景^[1-3]

快速DNA提取扩增试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

快速DNA提取扩增试剂盒

产品特点：

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

引物设计：

建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素）。引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

荧光探针设计：

在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt与目的片段互补的序列；5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。

操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2)每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针（引物和探针浓度为10μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3)向反应管中依次加入11.5μL ddH2O和2μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5μL）；

4)最后向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5)混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39ºC孵育8-12 mins；

6)反应结束后，取10μL加入含有190μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 mins内观察质控线与检测线判读结果。

应用^[4][5]

用于基于环介导等温扩增技术的羊乳中掺假牛乳的可视化快速检测方法研究

研究以牛、羊乳为研究材料,采用环介导等温扩增技术（LAMP）,以乳中DNA为检测对象,以SYBR GreenⅠ染料为反应指示剂,通过优化牛乳中DNA提取方法,建立了新型可视化环介导等温扩增检测牛羊乳掺假的方法。

本文的主要内容和研究结果如下:（1）牛乳中DNA提取试剂盒方法的建立。基于经典的苯酚-氯仿纯化方法,以牛乳为研究对象,针对消化温度、消化时间、十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K用量等关键参数依次进行优化,通过测定DNA品质筛选出的DNA提取条件,建立稳定的乳中DNA提取的试剂盒方法,并运用深加工的乳粉、高低温灭菌乳对所建立的试剂盒方法进行验证。结果表明:不同消化温度和消化时间,从乳中提取的总DNA、线粒体DNA和核DNA的完整性均良好,但DNA质量浓度和纯度有差异。消化温度为60℃、消化时间为10min、SDS用量和蛋白酶K用量均为50μL时,提取的DNA品质较优,是的DNA提取条件,DNA平均质量浓度为97ng/μL,平均纯度为1.44。优化参数后建立的试剂盒方法不仅适用于生鲜牛乳DNA提取,同样适用于液态和固态牛乳制品DNA提取。在所获得的DNA提取条件下,牛乳中体细胞裂解充分、彻底,所提取的DNA质量浓度和纯度较高,完整性良好,PCR扩增性能较强。

（2）基于LAMP技术的羊乳中掺牛乳快速检测方法的建立。在建立的乳中DNA提取试剂盒方法基础上,以Cytb基因为研究对象,使用2条外引物和2条内引物,特异性识别Cytb基因序列的6个区域。通过使用SYBR GreenⅠ染料实现了对扩增产物的闭管可视化检测,通过肉眼观察反应液颜色变化实现对反应结果的监测,同时将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增结果。分析了LAMP反应的特异性和灵敏度,并与传统的PCR检测效果进行对比。结果表明:阳性扩增样本反应液由橙色转变为绿色,阴性扩增样本反应液保持橙色不变,该可视化检测结果肉眼易于分辨和观察。所建立的LAMP体系能够特异性检测牛乳中的Cytb基因,其检测限为10 fg/反应,对羊乳中牛乳的检测灵敏度为0.01%。可视化检测结果和传统电泳检测结果一致,表明可视化检测可以取代传统电泳检测,同时可视化检测可以避免开盖检测造成气溶胶污染。

与传统的PCR方法比较,LAMP方法的灵敏度和检测限均高10倍,表明LAMP方法更快速、灵敏和经济。采用建立的方法检测羊乳中的牛乳制品,可以检测出0.01%的牛乳制品。该方法可在45 min完成羊乳中牛乳中的检测,仅需一个水浴锅即可完成检测,在牛乳掺假的快速检测中展现出巨大应用潜力。

参考文献

[1]Rapid detection of cow milk adulteration/contamination in goat milk by a lateral flow colloidal gold immunoassay strip[J].Bochao Liu,Jinhong Si,Fang Zhao,Qi Wang,Yu Wang,Jinfeng Li,Chengyao Li,Tingting Li.Journal of Dairy Research.2019(1)

[2]Purification procedures meaningfully influence DNA quantification in milk[J].Jing Liao,Yongfeng Liu.LWT.2018

[3]Direct duplex real-time loop mediated isothermal amplification assay for the simultaneous detection of cow and goat species origin of milk and yogurt products for field use[J].Mi-Ju Kim,Hae-Yeong Kim.Food Chemistry.2018

[4]Development of a fast duplex real-time PCR assay for simultaneous detection of chicken and pigeon in raw and heat-treated meats[J].Mi-ju Kim,Hae-Yeong Kim.Food Control.2018

[5]王一凡.基于环介导等温扩增技术的羊乳中掺假牛乳的可视化快速检测方法研究[D].陕西师范大学,2020.