COS-7细胞的应用

背景^[1-3]

COS-7细胞源自CV-1细胞株，经转染起始点缺失的SV40病毒突变体得到；编码表达野生型T抗原，所以该细胞适合作为需要SV40T抗原表达的载体的转染宿主。该细胞表达T抗原，允许SV40病毒的溶解性生长，支持40℃时温度敏感性A209病毒的复制，支持起始区域缺陷的SV40突变体的复制。因含有SV40病毒的DNA序列，该细胞需要在2级生物安全柜中操作。

COS-7细胞

复苏细胞步骤：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代步骤：

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞冻存步骤：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于UGT1A1基因野生型和Q239X突变型在cos-7细胞中的表达及功能研究

探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1Al（uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A1,UGT1A1）基因野生型和Q239X突变型在非洲绿猴肾细胞（cos-7细胞）中的表达及功能。

方法:构建UGT1A1基因野生型过表达、UGT1A1基因Q239X突变型过表达慢病毒载体和阴性慢病毒载体,分别对体外培养的cos-7细胞进行转染。转染72h后,荧光倒置相差显微镜及流式细胞仪观察和检测cos-7细胞的转染效率,用l.Omg/L嘌呤霉素筛选1周得到稳定转染细胞株,采用DNA测序鉴定所构建的稳定转染UGT1A1基因的cos-7细胞株。将cos-7细胞分为5组:空白对照组,阴性慢病毒组,UGT1A1基因野生型组,UGT1A1基因Q239X杂合突变型组,UGT1A1基因Q239X纯合突变型组。PCR、Real-Time PCR和Western Blot检测各组cos-7细胞中UGT1A1基因的DNA、mRNA和蛋白表达情况;绘制非结合胆红素的标准曲线,设计两组反应,野生型为对照组,Q239X杂合突变型为实验组,催化非结合胆红素与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA）的结合反应,利用高效液相色谱仪（High performance 1 iquid chromatograph,HPLC）定量检测非结合胆红素浓度变化,分析两组UGT1A1酶对非结合胆红素的催化活性。

结果:1.荧光倒置相差显微镜观察阴性病毒组、UGT1A1基因野生型组、UGT1A1基因Q239X杂合突变组、UGT1A1基因Q239X纯合突变组的cos-7细胞均可见明显的绿色荧光表达并且细胞状态良好,流式细胞仪检测转染效率均>85%,转染效率高,可用于后续实验。

2．DNA测序结果显示稳定过表达UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞株构建成功。

3．结合突变位点设计引物并进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞在DNA水平均可见UGT1A1基因表达,而空白对照组、阴性慢病毒组无UGT1A1基因表达。

4．Real-Time PCR结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞UGT1A1基因的mRNA表达量较空白对照组和阴性慢病毒组均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。但UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型细胞UGT1A1基因的mRNA表达量无显著差异（P>0.05）。

5．Western blot结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型cos-7细胞在55kD处可见UGT1A1蛋白表达,蛋白表达量有差异（P<0.05）,而空白对照组、阴性慢病毒组、Q239X纯合突变型组无UGT1A1蛋白表达。

6．绘制非结合胆红素的标准曲线,得到方程式:y=68028x+6813.7,R2=0.9923（其中x为非结合胆红素浓度μM,y为非结合胆红素峰面积）,非结合胆红素在0.25-2μM浓度范围内与非结合胆红素峰面积线性关系良好。

7．分别用UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型cos-7细胞模型匀浆催化非结合胆红素与UDPGA的葡萄糖醛酸化反应,UGT1A1野生酶和Q239X杂合突变酶在15min内的催化作用最强,使得结合胆红素的生成量,非结合胆红素浓度下降幅度,且Q239X杂合突变酶催化非结合胆红素浓度下降幅度低于UGT1A1野生酶。

结论:1.UGT1A1基因Q239X突变不影响基因的转录表达。

2. UGT1A1基因Q239X纯合突变使其翻译合成的谷氨酰胺变为终止密码子,基因表达终止,无UGT1A1蛋白生成。

3.UGT1A1基因Q239X杂合突变可表达UGT1A1蛋白,其生成的UGT1A1酶催化非结合胆红素能力低于UGT1A1基因野生型。

参考文献

[1]UGT 1A1 polymorphisms in rectal cancer associated with the efficacy and toxicity of preoperative chemoradiotherapy using irinotecan[J].Kei Kimura,Tomoki Yamano,Masataka Igeta,Ayako Imada,Song Jihyung,Akihito Babaya,Michiko Hamanaka,Masayoshi Kobayashi,Kiyoshi Tsukamoto,Masafumi Noda,Masataka Ikeda,Naohiro Tomita.Cancer Science.2018(12)

[2]UGT1A1*6 and UGT1A1*28 polymorphisms are correlated with irinotecan‐induced toxicity:A meta‐analysis[J].Yuwei Yang,MengMeng Zhou,Mingjun Hu,Yanjie Cui,Qi Zhong,Ling Liang,Fen Huang.Asia‐Pacific Journal of Clinical Oncology.2018(5)

[3]Relevance of CYP3A4*20,UGT1A1*37 and UGT1A1*28 variants in irinotecan‐induced severe toxicity[J].Pau Riera,Juliana Salazar,Anna C.Virgili,María Tobe?a,Ana Sebio,Pía Gallano,AgustíBarnadas,David Páez.British Journal of Clinical Pharmacology.2018(6)

[4]Publisher’s note[J].Cretaceous Research.2018

[5]羊希.UGT1A1基因野生型和Q239X突变型在cos-7细胞中的表达及功能研究[D].广西医科大学,2019.