人肿瘤蛋白P53(TP53)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人肿瘤蛋白P53(TP53)ELISA试剂盒运用双抗夹心法ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中TP53含量。

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA或肝素，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。然后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

人肿瘤蛋白P53(TP53)ELISA试剂盒

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品稀释液100μL，余孔分别加样品稀释液50ul和样品50μL，注意不要有气泡，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育30分钟。

2.洗板3次，弃去液体，甩干或吸干。每个孔中加入配制好的酶标抗体工作液100μL（在使用前30分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育30分钟。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，小约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.提前将TMB A组分和B组分37℃温育15分钟

5.按用量1：1混合TMB A组分和B形成TMB工作液（用干净的枪头分别吸取B组分和A组分），每孔加(TMB工作液)90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育7-10分钟（根据实际显色，情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。

6.每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

8.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

应用^[4][5]

用于基于靶向p53的化合物抗肺癌作用及机理研究

验证雄黄的抗肺癌活性,检测雄黄与SCLC药物的联合作用。为开拓砷剂的临床应用范围,和开发精准靶向突变型p53蛋白的抗肺癌中药提供理论基础。

方法:本实验采用MTT比色法、平板克隆形成实验,检测化合物对肺癌细胞和正常肺组织细胞的抗增殖能力;通IncuCyte实验,实时监测细胞活性及增殖情况;通过流式细胞术,检测化合物对细胞周期、细胞凋亡和活性氧水平的影响;通过蛋白质免疫印记分析（western blot,WB）实验检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达;通过CRISPR-Cas 9技术编辑H1975中的TP53基因,检测RYL-687对野生型p53细胞的选择毒性;

通过细胞核和胞浆蛋白的提取、免疫荧光实验,检测p53、NAD（P）H醌氧化还原酶-1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1,NQO1）在细胞核和胞浆的定位及蛋白水平表达;通过细胞浆蛋白和线粒体分离实验,检测RYL-687对胞浆和线粒体内细胞色素C蛋白的影响;通过加入蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）检测RYL-687对p53蛋白稳定性的影响;通过Pull-Down、银染和质谱分析实验,检测RYL-687的结合蛋白;

通过实时定量PCR（qRT-PCR）实验,检测RYL-687对TP53、MDM2、Bax转录水平的影响;通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,IP）实验检测RYL-687对p53和MDM2、p53和NQO1相互作用的影响;通过小干扰RNA实验检测敲低NQO1对RYL-687抗肺癌活性的影响;通过Seahorse细胞能量代谢分析实验检测RYL-687对细胞氧化磷酸化和糖酵解水平的影响。通过小鼠移植瘤实验检测小分子化合物的体内抗肺癌活性。

结果:通对喹啉的骨架进行修饰,合成了一系列小分子化合物。在H460、A549、H1975、H1299、HCC827、H520、HOP-62、16HBE、HLF细胞中检测其抗增殖能力,鉴定出抑制肺癌活性较好的小分子化合物RYL-687。同时发现RYL-687可选择性抑制野生型p53肺癌细胞的增殖,还可促进p53蛋白的稳定性和核定位。但RYL-687对突变型p53肺癌细胞的抗增殖能力却较弱。

为了验证RYL-687对野生型p53肺癌细胞的选择性靶向作用,利用CRISPR-Cas9技术敲除了H1975细胞内的突变TP53基因,再转入野生型TP53质粒,通过检测RYL-687对H1975基因编辑前后的增殖抑制作用,发现RYL-687对野生型p53肺癌细胞的选择性作用。又将RYL-687与常见的p53激活剂进行了对比,结果显示RYL-687在纳摩尔级浓度即可诱导p53,显著优于其它p53激活剂。

接下来深入研究了RYL-687的分子机制和体内抗肿瘤活性。RYL-687可以诱导细胞产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）,引发DNA损伤,上调核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）,上调NQO1。NQO1可保护p53不被20S蛋白酶体降解,诱导p53积累。

RYL-687通过结合NQO1而促进NQO1-p53复合物的形成,进而稳定p53蛋白。被RYL-687稳定的p53蛋白可激活下游靶基因Bax、p21和细胞色素C等,还可影响肿瘤能量代谢,导致肺癌细胞凋亡和S期阻滞。最后构建了肺癌细胞（H460）和患者异种移植瘤（PDX,已测序为TP53野生型）的小鼠模型,并给药治疗,结果显示RYL-687的前体药物在体内具有很好的抗肺癌效果。

参考文献

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[4][Treatment of non-small cell lung cancer].[J].Hopstaken J S,de Ruiter J C,van Diessen J N A,Theelen W S M E,Monkhorst K,Hartemink K J.Nederlands tijdschrift voor geneeskunde.2021

[5]于弘.基于靶向p53的化合物抗肺癌作用及机理研究[D].北京中医药大学,2021.