大鼠信号转导分子(SMAD1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠信号转导分子(SMAD1)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠信号转导分子(Smad1)水平。

实验原理：用纯化的大鼠信号转导分子(Smad1)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入信号转导分子(Smad1),再与HRP标记的信号转导分子(Smad1)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的信号转导分子(Smad1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠信号转导分子(Smad1)浓度。

大鼠信号转导分子(SMAD1)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于AlCl3抑制大鼠骨形成及BMP/Smad信号转导通路的机制研究

探讨AlCl3抑制大鼠骨形成及BMP/Smads信号转导通路的作用机制本实验以Wistar大鼠为研究对象,将200只4周龄大鼠随机分成实验组和对照组:实验组大鼠通过饮水染铝（AlCl3·6H2O）,饮用水中Al3+终浓度为64mg/kg体重;对照组大鼠饮用蒸馏水。各组大鼠采用大鼠标准饲料常规饲养,自由采食饮水,所有用具均不使用含铝制品。

实验设染铝后30d、60d、90d、120d四个检测点,每次以乙醚麻醉、眼球放血的方式处死实验组和对照组大鼠各25只,取血清及股骨组织。采用火焰原子吸收分光光度法测定血清和骨组织中铝含量;采用双能X线骨密度仪检测骨密度（BMD）;q RT-PCR技术检测BMP-2、BMPRI/II、Smad4、Runx2、Osterix、ALP、Col I、BGP mRNA的表达;western blot方法检测BMP-2、p-BMPRIA、p-Smad1/5/8、Runx2、Osterix蛋白的表达;免疫共沉淀方法检测p-Smad1/5/8/4复合物的入核情况,结果表明:（1）染铝组大鼠血清和骨中铝含量均显著高于对照组（P<0.01）,说明铝可在大鼠骨组织中蓄积。

（2）染铝组大鼠股骨前端和股骨干骺端骨密度从120d显著低于对照组（P<0.05）,说明铝可抑制大鼠骨形成作用。

（3）染铝组大鼠骨中ALP、ColImRNA表达量从60d显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）,而BGP mRNA表达量从30d显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）,说明AlCl3抑制大鼠骨形成相关因子的表达,骨中BGP的表达可作为铝抑制骨形成的早期诊断指标。

（4）染铝组大鼠骨中BMP-2、BMPRI/II、Smad4 mRNA表达量分别从60d,60d,30d显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）,BMP-2、p-Smad1/5/8、p-BMPR-IA蛋白表达量分别从90d,90d,60d显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）;染铝组细胞核中p-Smad1/5/8/4复合物蛋白表达量从60d显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）。说明AlCl3下调BMP/Smad信号通路的转导作用。

（5）实验期内,染铝组大鼠骨中Runx2、Osterix mRNA表达量和蛋白表达量均显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）,说明AlCl3抑制核转录因子活性。

参考文献

[1]Aluminum and iron can be deposited in the calcified matrix of bone exostoses[J].Daniel Chappard,Guillaume Mabilleau,Didier Moukoko,Nicolas Henric,Vincent Steiger,Patrick Le Nay,Jean-Marie Frin,Charlotte De Bodman.Journal of Inorganic Biochemistry.2015

[2]Runx2:Structure,function,and phosphorylation in osteoblast differentiation[J].S.Vimalraj,B.Arumugam,P.J.Miranda,N.Selvamurugan.International Journal of Biological Macromolecule.2015

[3]Cbl-b and c-Cbl negatively regulate osteoblast differentiation by enhancing ubiquitination and degradation of Osterix[J].You Hee Choi,Younho Han,Sung Ho Lee,Yun-Hye Jin,Minjin Bahn,Kyu Chung Hur,Chang-Yeol Yeo,Kwang Youl Lee.Bone.2015

[4]Effects of sub-chronic aluminum chloride exposure on rat ovaries[J].Y.Fu,F.B.Jia,J.Wang,M.Song,S.M.Liu,Y.F.Li,S.Z.Liu,Q.W.Bu.Life Sciences.2014(1)

[5]张湫悦.AlCl_3抑制大鼠骨形成及BMP/Smad信号转导通路的机制[D].东北农业大学,2016.