小鼠解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)ELISA试剂盒

背景^[1-3]

小鼠解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)ELISA试剂盒用于定量检测血清、血浆及相关液体样本中人解整合素样金属蛋白酶8ADAM8的含量。

实验原理：人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(AFABP)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被人脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aFABP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aFABP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠解整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于非小细胞肺癌患者ADAM8的表达及临床意义研究

研究解整合素-金属蛋白酶8（ADAM8）在人非小细胞肺癌（NSCLC）血清和组织中的表达规律,分析其与人NSCLC临床病理特征的关系,初步探讨ADAM8在NSCLC中的诊断价值,以及与癌胚抗原（CEA）联合检测的意义。

方法1、应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测62例非小细胞肺癌患者、27例良性肺病患者和32例健康体检者血清中ADAM8的蛋白表达水平,同时用放射免疫分析法（RIA）检测以上所有研究对象血清中CEA的蛋白表达水平。

2、应用组织芯片和免疫组织化学技术,检测96例NSCLC组织、36例癌旁组织及12例肺良性病变组织中ADAM8蛋白的表达情况。

结果：1、血清ADAM8、CEA水平在NSCLC组[（456.88±143.87）pg/mL,（18.69±8.99）ng/mL]均高于良性肺病组[（271.63±74.20）pg/mL,（3.70±1.37）ng/mL]和正常对照组[（253.09±72.15）pg/mL,（3.15±1.69）ng/mL],差异有统计学意义（P<0.01）,良性肺病组中ADAM8和CEA的表达水平与正常对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;

2、NSCLC组、良性肺病组和正常对照组三组研究对象中ADAM8和CEA的表达水平与性别或年龄无关（P>0.05）;

3、ADAM8在腺癌患者的表达水平[（462.54±161.38）pg/mL]与鳞癌[（449.04±118.03）pg/mL]相比差异无统计学意义（P>0.05）,而CEA在腺癌患者的表达水平[（20.93±10.57）ng/mL]比鳞癌[（8.31±4.50）ng/mL]高,经比较差异有统计学意义（P<0.05）;

4、Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者血清中ADAM8和CEA的表达水平[（498.80±151.80）pg/mL,（21.11±10.16）ng/mL]均高于Ⅰ～Ⅱ期患者[（385.80±95.85）pg/mL,（7.28±3.69）ng/mL],差异均有统计学意义（P<0.01）;

5、伴有淋巴结转移NSCLC患者血清中ADAM8和CEA的表达水平[（516.59±162.21）pg/mL,（26.61±12.48）ng/mL]均高于不伴有淋巴结转移者[（371.23±98.76）pg/mL,（6.97±4.27）ng/mL],差异均有统计学意义（P<0.01）;

6、ADAM8和CEA的ROC曲线下面积分别为0.911和0.895,选择335.0 pg/mL和5.0 ng/mL分别作为ADAM8和CEA的诊断界值时,单项检测ADAM8、CEA对NSCLC的敏感度分别为77.4%、71.0%,特异度分别为90.6%、84.4%,准确度分别为81.9%、74.5%。两者平行联合检测可以把敏感度及准确度提高到91.9%和86.2%,而特异度下降到75.0%。

7、ADAM8在NSCLC组织、癌旁组织及良性病变组织的阳性表达率分别为76.04%（73/96）、11.11%（4/36）、16.67%（2/12）,NSCLC组织与癌旁组织和良性病变组织相比较,差异有统计学意义（P<0.05）,而癌旁组织与良性病变组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）;

8、ADAM8在NSCLC患者的表达与TNM分期、淋巴结转移密切相关（P<0.05）,而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的组织学类型及分化程度无关（P>0.05）。

结论1、ADAM8在NSCLC组织中的表达水平较正常肺组织和肺良性病变组织的表达水平高,在NSCLC患者血清中的表达水平较肺部良性疾病和正常人的表达水平高,这表明ADAM8的异常表达与肺癌的发生有关。

2、ADAM8在NSCLC的异常表达与TNM分期、淋巴结转移密切相关,表明ADAM8在NSCLC的浸润、转移中起着重要作用。

3、检测血清中ADAM8的表达水平对NSCLC的诊断有一定的辅助价值,且其诊断价值稍优于CEA。

4、ADAM8、CEA单项检测对NSCLC诊断的敏感度和准确度都不够高,两者联合检测可提高NSCLC诊断的敏感度和准确度。

参考文献

[1]Expression of ADAM15 in lung carcinomas[J].Virchows Archiv.2005(4)

[2]Expression of ADAMs（a disintegrin and metalloproteases）and TIMP-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3）in human prostatic adenocarcinomas[J].Dev Karan,Frank Lin,Michael Bryan,J?erg Ringel,Nicolas Moniaux,Ming-Fong Lin,Surinder Batra.International Journal of Oncology.2003(5)

[3]Serum carcinoembryonic antigen level in surgically resected clinical stage i patients with non-small cell lung cancer[J].Noriyoshi Sawabata,Mitsunori Ohta,Shin-ichi Takeda,Hirotsugu Hirano,Yoshitomo Okumura,Hiroki Asada,Hajime Maeda.The Annals of Thoracic Surgery.2002(1)

[4]Detection of Micrometastatic Tumor Cells in pN0 Lymph Nodes of Patients With Completely Resected Nonsmall Cell Lung Cancer:Impact on Recurrence and Survival[J].Chun-Dong Gu,Toshihiro Osaki,Tsunehiro Oyama,Masaaki Inoue,Mantaro Kodate,Kazuhito Dobashi,Takeshi Oka,Kosei Yasumoto.Annals of Surgery.2002(1)

[5]黄金桔.非小细胞肺癌患者ADAM8的表达及临床意义研究[D].广州医学院,2009.