HCC827 人非小细胞肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

HCC827人非小细胞肺癌细胞建于1994年三月。这株肺腺癌在EGFR酪氨酸激酶区域有一个获得性突变(E746-A750缺失)。患者在25岁到26岁时每个月抽1包烟。在诊断前12年不再抽烟。

HCC827人非小细胞肺癌细胞

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，

应用^[4][5]

用于非小细胞肺癌中PD-L1的表达调控及其机制研究

1. NSCLC细胞株EGFR突变状态和PD-L1表达的相关性分析提取NSCLC细胞株的总DNA并用PNA-LNA PCR检测EGFR突变状态。流式细胞分析检测NSCLC细胞株的PD-L1表达水平。在NSCLC细胞株的培养环境中加入人源性重组EGF并用流式细胞分析和实时定量PCR检测其PD-L1的表达。

2. EGFR-TKIs对EGFR-TKI敏感型和获得性耐药型NSCLC细胞株PD-L1表达的影响体外实验部分,在NSCLC细胞株培养环境中加入不同剂量梯度（0、2.5、5、10、100nM）的吉非替尼刺激一定时间（48小时）或者加入同一剂量（100n M）吉非替尼刺激不同时间（0、6、12、24、48小时）,通过流式细胞分析和免疫荧光检测其PD-L1的表达。体内实验部分,裸鼠皮下注射nsclc细胞株,待肿瘤长至一定大小给予吉非替尼灌胃治疗,之后测量肿瘤的体积和重量以及用流式细胞分析和免疫荧光检测肿瘤组织中pd-l1的表达水平。

3. nsclc细胞株中egfr介导的pd-l1表达上调过程的机制研究体外实验部分,用westernblotting检测不同nsclc细胞株中nf-κbp65在胞浆和胞核的表达水平。用不同剂量（0、50、100μm）的nf-κb抑制剂pdtc刺激nsclc细胞株一段时间并用流式细胞分析检测其pd-l1表达。在nsclc细胞株培养环境中用不同剂量（0、2.5、5、10、100nm）吉非替尼刺激一段时间,用westernblotting分别检测其胞浆和胞核nf-κbp65的表达水平。体内实验部分,在上述的吉非替尼治疗的裸鼠荷瘤模型中,用免疫荧光检测各组裸鼠肿瘤组织中nf-κbp65的表达水平。

结果1.nsclc细胞株中egfr活化水平和pd-l1表达相关pna-lnapcr发现nsclc细胞株pc-9、hcc827和h1650具有egfr基因第19号外显子的突变而h460、h1299和spc-1a的egfr基因无突变。流式细胞分析显示egfr突变型细胞株的pd-l1比egfr野生型细胞株的pd-l1表达更高。流式细胞分析和定量pcr显示外源性rhegf刺激egfr野生型细胞株后能有效上调其pd-l1的表达。

2. 吉非替尼能够可逆性降低egfr突变型nsclc细胞株pd-l1的表达,且该作用具有浓度和时间依赖性流式细胞分析和免疫荧光显示不同浓度的吉非替尼刺激pc-9和hcc827一段时间或者一定浓度吉非替尼刺激pc-9和hcc827不同持续时间都能降低其pd-l1的表达水平,且降低程度与药物作用的浓度及时间呈正相关。同时,流式细胞分析发现撤去吉非替尼的刺激或者同时加入外源性rhegf能够恢复吉非替尼预处理的pc-9细胞株pd-l1的表达水平。

3.吉非替尼能够降低egfr-tki获得性耐药nsclc细胞株的pd-l1表达,并且该作用具有浓度和时间依赖性流式细胞分析显示吉非替尼也能够有效降低吉非替尼获得性耐药pc-9细胞株pd-l1的表达,并且pd-l1降低程度与吉非替尼作用的浓度和持续时间呈正相关。

参考文献

[1]The PD-1/PD-L1 pathway:biological background and clinical relevance of an emerging treatment target in immunotherapy[J].Simone Muenst,Savas D Soysal,Alexandar Tzankov,Sylvia Hoeller.Expert Opinion on Therapeutic Targets.2015(2)

[2]The Possibility of Traditional Chinese Medicine as Maintenance Therapy for Advanced Nonsmall Cell Lung Cancer[J].Weiru Xu,Guowang Yang,Yongmei Xu,Qing Zhang,Qi Fu,Jie Yu,Mingwei Yu,Wenshuo Zhao,Zhong Yang,Fengshan Hu,Dong Han,Xiaomin Wang,Senthamil R.Selvan.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2014

[3]The immunoinhibitory B7-H1 molecule as a potential target in cancer:Killing many birds with one stone[J].Sehar Afreen,Said Dermime.Hematology/Oncology and Stem Cell Therapy.2014(1)

[4]Afatinib versus cisplatin plus gemcitabine for first-line treatment of Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring EGFR mutations（LUX-Lung 6）:an open-label,randomised phase 3 trial[J].Yi-Long Wu,Caicun Zhou,Cheng-Ping Hu,Jifeng Feng,Shun Lu,Yunchao Huang,Wei Li,Mei Hou,Jian Hua Shi,Kye Young Lee,Chong-Rui Xu,Dan Massey,Miyoung Kim,Yang Shi,Sarayut L Geater.Lancet Oncology.2014(2)

[5]林凯龙.非小细胞肺癌中PD-L1的表达调控及其机制研究[D].第三军医大学,2015.