血凝块基因组DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

血凝块基因组DNA提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,提取血液中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料可以高效、专一吸附DNA,去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。

产品特点：

·样本适用广泛：可从抗凝血（EDTA，肝素等）、白膜层和血凝块等样品中直接提取基因组DNA；

·高质量：独特的裂解缓冲体系，纯化的DNA具有高浓度，高纯度，完整性好等特点，满足芯片杂交，高通量测序等实验需求；

·快速无毒：采用硅胶膜吸附原理，无需酚/氯仿，1h内即可完成实验。

·应用范围广：适用于酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等各种常规实验，和芯片杂交、高通量测序等下有实验。

血凝块基因组DNA提取试剂盒

使用方法：

使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1．处理血液材料（本产品适用于处理已添加抗凝剂的100μl-1ml血液样品）：

 a.当血液样品体积小于200μl时，可加缓冲液GS补足体积至200μl，再进行下一步实验（如血液样品体积为200μl，可直接进行下一步实验，不需加入GS)。

 b.当血液样品体积超过200μl时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：

 在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm（~11500×g)离心1 min，吸去上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次），向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

 c.如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20μl，可加缓冲液GS补足200μl后进行下面的裂解步骤。

2．加入20μl Proteinase K溶液，混匀。

3．加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。

4．加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5．将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm（~13400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6．向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7．向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8．重复操作步骤7。

9．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10．将吸附柱CB3转入1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。

应用^[4][5]

用于豚鼠和家兔封闭群动物DNA多态性检测方法的建立及应用研究

封闭群豚鼠微卫星标记检测方法的建立及初步应用首先,通过比较新鲜抗凝血Na I手提法、血凝块手提法和试剂盒DNA提取法三种血液基因组DNA提取方法,为后续实验提供简便、快捷的DNA提取方法。

其次,根据相关文献挑选出40个富含多态性的豚鼠微卫星位点,经过PCR条件优化、3%琼脂糖凝胶电泳和STR扫描筛选共获得25个扩增条带清晰、多态性高的微卫星位点。

再有,采用筛选出的25个多态性微卫星位点,建立封闭群豚鼠微卫星标记遗传质量检测方法,对A、B两个封闭群豚鼠进行遗传质量检测,并计算其群体遗传学参数,包括平均观测等位基因数、平均期望杂合度、平均多态信息含量等,然后进行了Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验和杂合子缺失检验。

群体统计学分析结果显示:A群和B群的平均观察等位基因数分别为4.12和4.64;平均有效等位基因数分别为2.4232和2.7947;平均观察杂合度分别为0.4467和0.5062;平均期望杂合度分别为0.5195和0.5838;平均多态信息含量分别为0.459和0.518;Hardy-Weinberg平衡检验显示,两个群体分别有5个位点和6个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.05）;杂合子缺失检验表明,两群体偏离遗传平衡的大多数位点表现出显著的杂合子缺陷（P<0.05）;不同微卫星位点群体间的平均Fst值为0.1056,即群体间的遗传变异占总遗传变异的10.56%,遗传分化程度为中等;两群体的Nei’s（1972）遗传距离和Nei’s（1978）无偏遗传距离分别为0.3302和0.3204。B群豚鼠遗传多样性略高于A群。

参考文献

[1]Single nucleotide polymorphisms in the FTO gene and their association with growth and meat quality traits in rabbits[J].Gong-Wei Zhang,Lian Gao,Shi-Yi Chen,Xiao-Bing Zhao,Yao-Fu Tian,Xia Wang,Xiao-Song Deng,Song-Jia Lai.Gene.2013

[2]Identification of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157‐Specific DNA Sequence Obtained from Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis[J].Akihiko Tokunaga,Masanori Kawano,Masatoshi Okura,Sunao Iyoda,Haruo Watanabe,Ro Osawa.Microbiology and Immunology.2007(9)

[3]High levels of nucleotide diversity in the European rabbit（Oryctolagus cuniculus）SRY gene[J].A.Geraldes,C.Rogel‐Gaillard,N.Ferrand.Animal Genetics.2005(4)

[4]Impact of genetic profiles on experimental studies:outbred versus wild rats[J].Toxicology and Applied Pharmacology.2003(1)

[5]李芳芳.豚鼠和家兔封闭群动物DNA多态性检测方法的建立及应用[D].中国食品药品检定研究院,2015.