大鼠去甲肾上腺素(NA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠去甲肾上腺素(NA)ELISA KIT用于检测血浆，血清及相关液体等样本中去甲肾上腺素(NA)的含量。

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠去甲肾上腺素（NA）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠去甲肾上腺素（NA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠去甲肾上腺素(NA)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速，小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对慢性间歇低氧大鼠颏舌肌中枢调控的影响研究

通过建立慢性间歇低氧模型大鼠来模拟临床OSA患者反复间歇低氧的特点。在低氧的不同时间点,通过观察大鼠颏舌肌肌电图（Electromyogram,EMG）、TMS反应及相关受体的变化等,来探讨慢性间隙低氧A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌中枢调控的作用及机制,进而为OSA患者的临床诊断与治疗提供新的理论依据。

方法:1.在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体与GIRK通道对颏舌肌的中枢调控的影响。选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,随机分为常氧组（NO组,n=8）、IgG-SAP给药组（IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（SAP组,n=8）、NACL给药组（NACL组,n=8）、Clonidine给药组（CLO组,n=8）、RS-79948给药组（RS组,n=8）、ML297给药组（ML组,n=8）、Tertiapin-Q给药组（TER组,n=8）、Tertiapin-Q/Clonidine给药组（TC组,n=8）与ML297/RS-79948给药组（MR组,n=8）。

通过免疫组化及免疫荧光明确去甲肾上腺素能神经元在脑中的分布,利用琼脂糖凝胶模型模拟药物在脑内的扩散,通过脑立体定位仪进行A7细胞群去甲肾上腺素能神经元定位。将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP、α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948、GIRK通道激动剂ML297与GIRK通道阻断剂Tertiapin-Q分别微量注射入相应实验组大鼠的A7细胞群。另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证常氧条件下A7去甲肾上腺能神经元及α2受体与GIRK通道对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。

2.慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体对颏舌肌的中枢调控的影响及可能机制探讨。

选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,建立慢性间歇低氧（Chronic Intermittent Hypoxia,CIH）模型。实验大鼠每天于8:00 AM-4:00 PM置于低氧舱共8小时,以7天为一周期,持续4个周期共28天。每次缺氧-复氧循环时间为188s,舱内氧浓度呈周期波动于10%至21%之间。慢性间歇低氧大鼠被随机分为单纯慢性间歇低氧组（CIH组,n=32）、IgG-SAP给药组（CIH+IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（CIH+SAP组,n=8）、Clonidine给药组（CIH+CLO组,n=8）、RS-79948给药组（CIH+RS组,n=8）、NACL给药组（CIH+NACL组,n=8）。参考既往文献,通过立体定位技术,将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP注射入CIH-SAP组大鼠的A7细胞群。α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948在实验进行当天被分别注射进入CIH-CLO与CIH-RS组大鼠的A7细胞群。

另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,在每一低氧周期结束当天,即低氧的第7、14、21、28天,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证慢性间歇低氧条件下A7细胞群去甲肾上腺能神经元及其上α2受体对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。另有CIH组大鼠在每一低氧周期结束当天被处死,进行脑组织灌流取材及标本切片,进行冰冻切片免疫组化。比较低氧不同时间点A7细胞群去甲肾上腺素能神经元多巴胺-β-羟化酶（Dopamineβ-hydroxylase,DBH）、舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢、α1受体及α2受体蛋白的表达情况。以此来探讨慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌的中枢调控影响的可能机制。

参考文献

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[4]Sleep and Nocturnal Gastroesophageal Reflux:An Update[J].Kaiser G.Lim,Timothy I.Morgenthaler,David A.Katzka.Chest.2018

[5]聂昕时.A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对慢性间歇低氧大鼠颏舌肌中枢调控的影响[D].中国医科大学,2019.