ECL化学发光试剂盒的应用

背景^[1-3]

ECL化学发光试剂盒是一种超敏ECL化学发光试剂盒，本产品与二抗上偶联的辣根过氧化物酶发生化学反应，发出萤光，从而可以通过用X光片压片或其它适当化学发光成像设备检测样品。

ECL化学发光试剂盒是用于检测HRP或其标记产物的化学发光试剂，可用于western blot或ELISA等实验的检测。分为普通型ECL化学发光试剂盒（高质量鲁米诺底物，检测灵敏度10-100pg HRP）和增强型ECL化学发光试剂盒（采用更稳定、发光量子产率更高的反应底物，检测灵敏度1pg HRP）。两款试剂盒发光强度均可以稳定持续30min以上。

ECL化学发光试剂盒

原理：

超敏型ECL化学发光底物试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体、抗原或者核酸。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸，洗膜后置于用本产品配制的ECL工作液中，室温孵育数分钟，HRP使工作液中的鲁米诺（Luminol）氧化并发光，试剂中添加的增强剂可以使得这种发光大大增强。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来，可清晰显示蛋白质或核酸条带。

使用方法：

1.印迹膜制备：执行常规电泳、转膜、HRP标记的抗体或者HRP标记的核酸探针孵育、洗膜；ECL工作液含有HRP催化的发光底物，检测系统必须基于HRP酶标记的抗体或者核酸探针。充分的洗涤对于降低背景非常重要，所有步骤均在室温下完成。

2.ECL工作液的配置：在使用前取等量A液和B液，混合均匀并尽快使用；将膜片置混合液中，于室温下孵育约1分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2 ml以覆盖全膜片，注意不要在膜片表面形成气泡。

3.蛋白或核酸信号显现：

1).用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸上以吸去过量试剂，仅留下少量液体覆盖表面，不可让膜完全干燥；

2).将膜片置于保鲜膜上，吸附蛋白面朝上，小心赶尽气泡；

3).用电子装置感光，或在暗室中用X光片曝光；

4).根据信号强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次曝光，以取得更佳效果。

应用^[4][5]

用于基于免疫传感新方法的外源蛋白分析研究

外源蛋白分析方法,包括酶联免疫吸附分析（ELISA）、免疫印迹法和免疫层析试纸条等方法,多采用比色法检测,分析灵敏度不足。最近发展的荧光免疫分析、化学发光免疫分析、免疫聚合酶链式反应（PCR）分析等可以实现外源蛋白高灵敏分析,然而仍无法实现转基因现场即时（POCT）定量分析,不能满足基于低阈值的转基因标识制度管理的要求。

基于纳米材料作为固相载体和信号探针载体开发免疫传感新方法以提高外源蛋白分析灵敏度,实现简单、快速、POCT定量分析。

（1）高灵敏免标记电致化学发光免疫传感器用于转基因作物中外源蛋白PAT/bar定量分析本文利用打印机碳粉通过简易方法合成新型碳球纳米粒子（CNPs）,基于该纳米材料作为抗体载体和高效电极材料首次构建了免标记电致化学发光（ECL）免疫传感器,用于转基因油菜中外源蛋白PAT/bar高灵敏分析。在本研究中,将CNPs与PAT/bar蛋白通过戊二醛偶联,并用于玻碳工作电极修饰。在分析中,PAT/bar蛋白与固定的抗体发生免疫反应,在传感器表面形成一层免疫复合物,从而抑制了电极表面与ECL活性物质之间的电子转移,导致ECL信号降低。在优化条件下,PAT/bar蛋白在0.10-10 ng m L-1范围内与ECL信号强度呈良好的线性关系,检测限为0.050 ng m L-1,与已报道的PAT/bar蛋白分析方法相比,该方法显著提高了分析灵敏度。用转基因油菜RF3作为实验材料评价该传感器的适用性,其检测限达0.020%,显示出与PCR方法可比拟的灵敏度。凭借高灵敏ECL检测技术和新型CNPs材料的应用,本文开发的免标记ECL免疫传感器显著提高了外源蛋白分析灵敏度,为转基因成分分析提供了一个有前景的通用型分析平台。

（2）便携式电化学免疫传感器用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT定量分析迄今为止转基因高灵敏POCT定量分析技术的开发尚未报道。本研究采用微型化丝网印刷碳电极（SPCE）作为检测电极,与开发的手持式电化学分析仪集成,基于纳米信号放大探针研发便携式电化学免疫传感器系统,用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT分析。本研究中,通过简单方法将转基因靶标单抗和辣根过氧化物酶（HRP）同时修饰在Au NPs表面制备双标记Au NPs,作为信号放大探针。相比于使用传统的HRP标记抗体作为信号探针,该纳米探针的使用可以显著提高分析灵敏度达62.5倍。在优化条件下,便携式免疫传感器可以在0.10-10 ng m L-1范围内实现对于CP4-EPSPS蛋白的定量分析,检测限低至0.050 ng m L-1,全程分析时间在65 min内。该方法用于转基因作物检测并用商业化ELISA试剂盒进行验证,结果显示两者分析结果的相关系数为0.9909。

因此,提出的便携式电化学免疫传感器系统为外源蛋白高灵敏POCT定量分析提供了可靠的平台。

（3）高灵敏免疫传感平台用于外源蛋白Cry1Ab一步式定量分析。基于上述高灵敏双标记Au NPs信号探针,结合标记有捕获抗体的免疫磁珠进一步开发了高灵敏免疫传感平台,用于外源蛋白Cry 1Ab比色法和化学发光法检测。基于免疫磁珠的分离富集作用,该免疫传感平台利用比色法检测时可以在1.5 h内实现Cry1Ab一步式定量分析,线性范围为1.0-40 ng m L-1,检测限为0.50 ng m L-1。与使用商业化HRP偶联抗体作为信号探针方法相比,该方法的灵敏度提高了15.3倍。同时,高灵敏化学发光法成功应用于该免疫传感平台构建。在0.10-20 ng m L-1的线性范围内,可以实现对Cry1Ab最低检出浓度为0.050 ng m L-1的定量分析。

参考文献

[1]Novel amperometric genosensor based on peptide nucleic acid（PNA）probes immobilized on carbon nanotubes-screen printed electrodes for the determination of trace levels of non-amplified DNA in genetically modified（GM）soy[J].Simone Fortunati,Andrea Rozzi,Federica Curti,Marco Giannetto,Roberto Corradini,Maria Careri.Biosensors and Bioelectronics.2019

[2]Recent advances in emerging DNA-based methods for genetically modified organisms（GMOs）rapid detection[J].Cheng Qian,Rui Wang,Hui Wu,Jianfeng Ping,Jian Wu.Trends in Analytical Chemistry.2018

[3]A pH-responsive bioassay for paper-based diagnosis of exosomes via mussel-inspired surface chemistry[J].Yi Yang,Chao Li,Hai Shi,Tianshu Chen,Zhaoxia Wang,Genxi Li.Talanta.2018

[4]Ultrasensitive and portable assay of mercury（II）ions via gas pressure as readout[J].Jing Lei,Lu Shi,Baoxin Li,Chaoyong James Yang,Yan Jin.Biosensors and Bioelectronics.2018

[5]高鸿飞.基于免疫传感新方法的外源蛋白分析研究[D].华中农业大学,2020.