人生长激素ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人生长激素ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人生长激素（GH）的含量。

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人生长激素（GH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人生长激素（GH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人生长激素ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达研究

根据人生长激素的氨基酸序列和酵母菌密码子的偏好性,对人生长激素基因的密码子进行全局优化,屏蔽所有的稀有密码子,在其上游添加了启动子和信号肽序列,拟合成序列全长1040 bp,共设计并利用化学方法合成了30条单链寡核苷酸。通过改进的两步法进行生物拼接成全基因,再克隆到pUC18载体中,经过篮白筛选,挑取阳性克隆测序,得到2个全正确的克隆。

通过聚合酶链式反应技术来扩增得到了生长激素基因,然后将扩增得到的生长激素基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,该载体拥有AOX1启动子和α分泌信号肽序列,构建出pPIC9K/hGH重组酵母表达载体,然后再利用电击转化毕赤酵母GS115,利用G418筛选菌株,得到整合多拷贝人生长激素基因,该基因株通过进一步的摇瓶培养生长,再通过甲醇的诱导,成功实现了生长激素在毕赤酵母中的分泌表达。

然后使用SDS-PAGE技术进行活性分析。经聚合酶链式反应技术扩增酵母基因组DNA的结果显示,目的基因已被成功的整合到了毕赤酵母的染色体当中。筛选出的菌株用甲醇来诱导表达重组目的蛋白,使用SDS-PAGE和Western Blotting技术对表达的产物进行鉴定,在22kD附近存在一条很明显的带,并且颜色随诱导时间的增加而越来越深。

而对照组没有出现条带,Western blotting鉴定的结果表明该重组蛋白为重组人生长激素。利用Folin-酚法测定标准浓度的酪蛋白,测得上清中的总蛋白含量是1.21mg/ml。用ELISA法测定样品的hGH的OD490值为0.217,通过标准曲线的公式计算得出,上清中的hGH的含量是330μg/ml。由此计算得出hGH占上清总蛋白的27.2%。将3K超滤后的样品进行步层析时,选用Q-sepharose FF为层析介质,10mM PB,pH7.5为上样缓冲液,采用10%Solution B阶段洗脱目的蛋白;在第二步层析时,选用phenyl-sepharose FF为层析介质,10mM PB+1M（NH4）2SO4,pH7.5为上样缓冲液,并用10mM PB,pH7.5作为洗脱缓冲液,经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。

经过基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOF MS）测定,重组hGH的相对分子质量为22 113 Da,N-端氨基酸测序显示rhGH的N-端的7个氨基酸为PTIPLSR。重组hGH的生物学活性利用去脑垂体大鼠体重法测定,实验可靠性测验符合标准,同批rhGH样品的PT为4.29 IU/1.33 mg,代表试验误差的可信限率（FL）26.6%,比活为3.2 IU/mg。此外还优化了rhGH的发酵工艺,能够使rhGH蛋白质的表达水平得到很大的提高。

总之,本实验为生产高纯度人生长激素rhGH提供了有效的发酵工艺,可以降低大规模生产人生长激素的生产成本,建立了能够高效表达人生长激素的毕赤酵母表达系统,为重组人生长激素的工业化大规模生产打下了坚实的基础。

参考文献

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[2]Effects of growth hormone and insulin‐like growth factor I on T‐and B‐lymphocytes and immune function[J].M.Geffner.Acta Paediatrica.2012(S423)

[3]Enhancement of cell viability and alkaline polygalacturonate lyase production by sorbitol co-feeding with methanol in Pichia pastoris fermentation[J].Zhihao Wang,Yun Wang,Dongxu Zhang,Jianghua Li,Zhaozhe Hua,Guocheng Du,Jian Chen.Bioresource Technology.2009(4)

[4]Novel Secretion System of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Using an N‐terminus Residue of Human IL‐1βas Secretion Enhancer[J].JeewonLee,Seong‐IIChoi,Jun SungJang,KiryongJang,Jae WoongMoon,Cheon SoonBae,Doo SukYang,Baik LinSeong.Biotechnol Progress.2008(5)

[5]郭丹.人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达[D].吉林大学,2020.