植物激素脱落酸(ABA )ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

植物激素脱落酸(ABA)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中植物激素脱落酸(ABA)的表达水平。

实验原理：往预先包被激素脱落酸（ABA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的激素脱落酸（ABA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

植物激素脱落酸(ABA)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法

1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。

4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

3.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

4.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

5.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于细胞分裂素与脱落酸信号通路拮抗调控拟南芥逆境应答的分子机制研究

植物激素在抵御逆境胁迫过程具有十分重要的作用。“逆境激素”脱落酸（abscisic acid,ABA）在植物种子萌发和应答逆境中起非常重要的作用,如当植物遭受干旱胁迫时,植物体内合成大量ABA,导致气孔关闭,蒸腾效率降低,从而增强植物的抗旱能力。

细胞分裂素也参与调控植物对逆境胁迫的响应,有证据表明细胞分裂素（cytokinin,CK）和ABA信号在调控种子萌发和对逆境响应的过程中可能存在拮抗的关系,但是其调控的分子机制并不清楚。研究发现,细胞分裂素信号中的应答调节子B型ARRs拮抗ABA信号通路,调节植物对ABA和干旱胁迫的响应。生化证据显示,细胞分裂素信号途径关键转录因子B型ARR1、ARR11和ARR12可以与ABA信号途径重要蛋白激酶SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6/OST1分别发生相互作用。

进一步研究发现,B型ARRs抑制ABA激活SnRK2.6/OST1的激酶活性,从而负调控ABA信号转导。遗传分析表明,B型ARRs作用于SnRK2s上游,snrk2.2,2.3在种子萌发早期部分同复arr1,11,12的ABA敏感表型,而snrk2.6/ost1-3部分问复arr1,11,12的抗旱表型。以上实验结果表明,细胞分裂素信号B型ARRs作用于SnRK2s的上游抑制其激酶活性,负调控ABA信号转导从而调节植物对ABA和干早胁迫的响应。

还发现细胞分裂素信号途径负调节子A型ARR5是ABA信号通路正调控因子。研究报道arr5突变体具有微弱的ABA不敏感表型,本研究发现ARR5的过表达植株具有ABA超敏感和抗旱的表型。

遗传分析发现ARR5作用于SnRK2s下游,过量表达ARR5能部分回复snrk2.2,2.3的ABA不敏感表型和snrk2.6/ost1-3的干旱敏感表型。进一步研究发现SnRK2.6/OST1可以在体外磷酸化入ARR5的Ser21、Ser33、Ser72和Ser117残基。ABA增强ARR5蛋白稳定性,在突变体snrk2.2,2.3和snrk2.6/ost1-3中ARR5蛋白明显减少,说明ABA-SnRK2s介导的ARR5磷酸化影响其蛋白稳定性。突变形式的ARR54A转基因植株的抗冻能力以及对ABA和细胞分裂素的响应无法模拟ARR5转基因株系,而与野生型一致,说明这四个位点的磷酸化影响ARR5调节植物对ABA和干旱逆境胁迫的应答。

此外,发现外源ABA抑制细胞分裂素信号活性。ABA信号途径中的重要转录因子ABI4直接结合A型ARR6、ARR7和ARR15启动子区CACCG基序,并在转录水平抑制它们的表达。ARR6、ARR7和ARR15的单突变体和多突变体都表现出ABA敏感表型,并且Marr7 arr15部分回复abi4的ABA不敏感表型。以上实验结果表明ARR6、ARR7和ARR15作为ABI4的下游靶基因调控种子萌发对ABA的响应。

参考文献

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[5]黄小珍.细胞分裂素与脱落酸信号通路拮抗调控拟南芥逆境应答的分子机制[D].中国农业大学,2017.