双甲基精氨酸水解酶2抗体的应用

背景^[1-3]

双甲基精氨酸水解酶2抗体是一类可以特异性结合双甲基精氨酸水解酶2的多克隆抗体，主要用于检测双甲基精氨酸水解酶2的体外免疫学实验。

甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)是众所周知的参与糖酵解的关键酶之一。除了在细胞质中作为糖酵解酶发挥作用外，最近的证据表明哺乳动物GAPDH还参与大量细胞内过程，例如膜融合、微管束、磷酸转移酶活性、核RNA输出、DNA复制和DNA修复。在过去十年中，出现了大量关于GAPDH在不同病理中的作用的数据，包括前列腺癌进展、程序性神经元细胞死亡、与年龄相关的神经元疾病，例如阿尔茨海默氏症和亨廷顿氏病。GAPDH在所有细胞中都有表达。它在几乎所有组织中以高水平组成型表达。然而有一些生理因素，如缺氧和糖尿病，会增加某些细胞类型中GAPDH的表达。GAPDH分子由四个36kDa亚基组成。

双甲基精氨酸水解酶2免疫组化

双甲基精氨酸水解酶同时具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶和亚硝基化酶活性，从而分别在糖酵解和核功能中发挥作用。参与核事件，包括转录、RNA转运、DNA复制和细胞凋亡。核功能可能是由于亚硝基化酶活性介导核靶蛋白如SIRT1、HDAC2和PRKDC的半胱氨酸S-亚硝基化。3-磷酸​​甘油醛脱氢酶是糖酵解中的关键酶，它通过将D-甘油醛3-磷酸(G3P)转化为3-磷酸-D-甘油酰磷酸来催化该途径的步。

应用^[4][5]

用于二甲基精氨酸二甲胺水解酶2重组蛋白纯化及功能研究

研究表明,内源性一氧化氮合酶（NOS）抑制物—非对称性二甲基精氨酸（ADMA）是导致血管内皮功能不全的重要物质。二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）是内源性ADMA的主要代谢酶。已知DDAH存在两种亚型——DDAH1和DDAH2;前者主要分布于表达神经型NOS的组织,后者则主要分布于表达内皮型NOS的心血管组织;因此,DDAH2是决定心血管系统ADMA含量的关键因素。但目前尚无直接增加DDAH2表达和活性的药物。

近年来发现一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1 Tat（Trans-activator transcription）蛋白的蛋白功能区,称之为PTD区段（Protein transduction domain）,能有效地引导肽段或蛋白质进入细胞,具有蛋白传送功能。因此,本课题将Tat PTD区段融合于人DDAH2蛋白的N端,使DDAH2蛋白具备穿膜能力,定位于细胞内并发挥作用。在此基础上,用多种心血管的危险因子如高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如棕榈酸处理培养的人脐静脉内皮细胞系（HUVEC-12）,观察上述因素对细胞内DDAH1和DDAH2表达及DDAH活性的影响;并进一步探讨外源性给予Tat-hDDAH2蛋白能否直接增加细胞中DDAH2蛋白含量,抵抗上述因素对DDAH活性的抑制,从而为大规模开发可应用的重组蛋白产品奠定技术基础,为心血管疾病防治拓开新途径。

另一方面,用重组的DDAH2融合蛋白作为抗原,制备家兔来源的抗血清,用于DDAH2表达的检测。

方法：①构建重组pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2原核表达载体:以我室以前构建pcDNA3.1-hDDAH2质粒为模板,用Tat-hDDAH2上下游引物扩增Tat-hDDAH2基因,重组到T载体上,构建pGEM-Tat-hDDAH2质粒,然后再分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切pGEM-Tat-hDDAH2和原核表达载体pGEX-6p-1,连接重组成pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2载体;再转化到宿主大肠杆菌BL21体内诱导表达,并通过优化诱导条件提高目的基因的原核表达水平和可溶性融合蛋白的含量。

②重组Tat-hDDAH蛋白的纯化:将包涵体形式的重组蛋白溶于8mol/L的尿素溶液中,然后经过复性、透析得到复性蛋白GST-Tat-hDDAH;再将从细菌裂解液上清中的可溶性GST-Tat-hDDAH蛋白和从包涵体中得到的复性蛋白与还原型谷胱甘肽琼脂糖珠（Glutathione Sepharose 4B）充分混匀,经过Glutathione Sepharose4B的亲和吸附得到纯化的GST-Tat-hDDAH2融合蛋白,最后经过PreScission蛋白酶切,获得重组的Tat-hDDAH2蛋白。

③抗hDDAH2抗血清的制备:重组pGEX-6p-1-hDDAH2载体;再转化到宿主细菌体内进行诱导表达,得到大量含GST-hDDAH2蛋白的包涵体;经2%的脱氧胆酸钠溶液洗涤后得到较纯化的包涵体,并将其作为抗原与佐剂充分乳化后经皮下注射免疫新西兰大白兔,制备抗DDAH2的多克隆抗体,并用ELISA、western blot检测DDAH2抗体的滴度和特异性,用于后续实验中DDAH2蛋白表达的检测。

④重组Tat-hDDAH2蛋白的功能实验:培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC-12,分别用心血管疾病的危险因子高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如棕榈酸（palmitic acid,PA）孵育HUVEC-12 16～48h,检测这些危险因子对内皮细胞DDAH1和DDAH2蛋白表达和DDAH活性的影响;并观察Tat-hDDAH2蛋白能否逆转上述因素对DDAH活性的损害。

参考文献

[1]Rosiglitazone Prevents Free Fatty Acid-Induced Vascular Endothelial Dysfunction[J].Friedrich Mittermayer,Georg Schaller,Johannes Pleiner,Katarzyna Krzyzanowska,Stylianos Kapiotis,Michael Roden,Michael Wolzt.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2007(7)

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[4]Asymmetric dimethylarginine induces apoptosis via p38 MAPK/caspase-3-dependent signaling pathway in endothelial cells[J].De-Jian Jiang,Su-Jie Jia,Zhong Dai,Yuan-Jian Li.Journal of Molecular and Cellular Cardiology.2006(4)

[5]吴忠祖.二甲基精氨酸二甲胺水解酶2重组蛋白纯化及功能研究[D].中南大学,2007.