蔗糖, 用于植物细胞培养的应用

背景^[1-3]

蔗糖,用于植物细胞培养是由一分子果糖和一分子葡萄糖组成的,蔗糖是可以直接进入细胞的,蔗糖跨质膜从质外体进入细胞是由载体介导并需要消耗能量的质子-蔗糖共运输机制进行的,另外,植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等.葡萄糖更不稳定,培养基需添加葡萄糖一般都在灭菌后再兑换。实在要添加葡萄糖那么灭菌温度一般控制在108~110左右,120度灭出来的就有一定程度的碳化了，所以用蔗糖更简单。

植物细胞培养中最常用的培养基的碳源是蔗糖,已知葡萄糖和果糖也能使某些植物生长得很好，植物细胞可以分解蔗糖。

蔗糖,用于植物细胞培养基

植物组织培养的培养基中，需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。

蔗糖作为碳源，主要有以下两个方面的原因：

（1）同样作为碳源物质为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。

（2）植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。

应用^[4][5]

用于仙茅细胞悬浮培养生产仙茅苷的研究

仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）为石蒜科仙茅属多年生草本,又名地棕、独茅、仙茅参,其根茎入药,主要用于治疗肾阳不足、阳痿遗精、虚痨内伤,筋骨疼痛等病症。随着对仙茅药用价值的深入了解,仙茅市场需求逐渐加大,仙茅野生资源受到破坏而大量减少,人工栽培仙茅也因土地资源、农药残留、季节影响、活性成分含量差异等因素影响而受到了限制。

因此决定采用植物细胞工程技术来生产仙茅苷,可以缩短仙茅资源的利用周期,更有效的保护仙茅种质资源,有利于仙茅产业的可持续发展与产业升级。本文以仙茅为材料,采用幼叶作为外植体诱导产生愈伤组织,经反复继代后,以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA为培养基,在温度为25℃,转速120 r/min,光照12 h/d,光照强度1 200 lx条件下进行培养21d,成功建立了悬浮细胞系。

对悬浮细胞系在培养过程中的生物量、pH、PAL酶活性和代谢产物进行了相关研究,结果表明悬浮细胞系在一定的培养周期内能产生仙茅苷等代谢产物,但含量较低,且与细胞生物量,PAL酶活性,pH变化呈相关关系。

通过响应面试验设计研究接种密度、振荡频率、碳源浓度、以及生长调节剂2,4-D等因素对细胞增殖的影响,结果表明:各因素促进细胞增殖的响应水平为,接种量73.94 g/L、2,4-D0.59mg/L、摇床转速103.75 r/min、碳源浓度40.28g/L,在此条件下经实验验证,所得悬浮细胞生长良好,生物量为15.26±0.3×105个/mL。

通过研究不同光照、温度、pH条件处理对仙茅细胞生长与仙茅苷合成的影响,结果表明,光照条件为12h/d,1200x,温度为26℃时,初始pH为5.8～6.2时,有利于仙茅细胞生长与仙茅苷的合成。通过研究不同前体和诱导子条件处理对仙茅细胞生长与仙茅苷合成的影响结果表明,添加L-苯丙氨酸、茉莉酸甲酯、水杨酸均能促进仙茅苷的生物合成。

当L-苯丙氨酸为100mg/L时,仙茅苷的含量最高为3.32±0.18 mg/g干重,为对照组的2.48倍。茉莉酸甲酯为100μmol/L时,仙茅苷含量最高为2.54±0.24 g/L干重,为对照组1.85倍。水杨酸为50μmol/L,仙茅苷含量最高为3.088 mg/g干重,为对照组的2.36倍。

通过研究前体和诱导子处理对悬浮细胞培养液PAL酶活、总糖耗量和pH变化的影响,结果表明,前体L-苯丙氨酸,诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸均能加大细胞的糖耗量,诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸可提高悬浮细胞PAL酶活性与悬浮培养液pH。

参考文献

[1]Curculigoside promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells from ovariectomized rats[J].Qingping Shen,Deliang Zeng,Yong Zhou,Lunguo Xia,Yanfan Zhao,Guangyang Qiao,Lianyi Xu,Yan Liu,Ziyuan Zhu,Xinquan Jiang.J Pharm Pharmacol.2013(7)

[2]Medicinal plants of genus Curculigo:Traditional uses and a phytochemical and ethnopharmacological review[J].Yan Nie,Xin Dong,Yongjing He,Tingting Yuan,Ting Han,Khalid Rahman,Luping Qin,Qiaoyan Zhang.Journal of Ethnopharmacology.2013(3)

[3]Two new triterpenoid glycosides from Curculigo orchioides[J].Ai-Xue Zuo,Yong Shen,Zhi-Yong Jiang,Xue-Mei Zhang,Jun Zhou,Jun Lü,Ji-Jun Chen.Journal of Asian Natural Products Research.2012(5)

[4]Cycloartane glycosides from the rhizomes of Curculigo orchioides[J].Akihito Yokosuka,Koji Sato,Yoshihiro Mimaki.Phytochemistry.2010(17)

[5]邹璐.仙茅细胞悬浮培养生产仙茅苷的研究[D].中南林业科技大学,2019.