猪白介素1(IL-1)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

猪白介素1(IL-1)ELISA KIT是利用ELISA法定量测定猪血清、血浆或其它相关液体中白介素1（IL-1）含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中IL-1水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-1抗原、生物素化的抗鸡IL-1抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

猪白介素1(IL-1)ELISA KIT

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于锌对仔猪及小肠上皮细胞免疫功能的调节作用研究

以断奶仔猪和小肠上皮细胞（IPEC-J2）为试验模型,通过四个试验考察了锌对不同免疫状态下仔猪和小肠上皮细胞免疫功能的调节作用。试验一日粮锌水平对仔猪生长性能和免疫功能的影响本试验采用单因子设计,选用72头28日龄断奶的杂交仔猪（DLY）,在基础日粮中分别添加0、60、120mg/kg锌（ZnSO4）,研究了日粮锌水平对断奶仔猪生长性能、组织锌含量、碱性磷酸酶活性、外周血淋巴细胞转化率、牛血清白蛋白（BSA）抗体水平、肝脏金属硫蛋白（MT）含量及MTmRNA水平的影响。试验全期共21天。

试验结果表明:在本试验条件下,不同锌添加水平对断奶仔猪生长性能、组织锌含量、外周血淋巴细胞转化率、肝脏MT含量及MTmRNA水平无显著影响（P＞0.05）;随日粮锌水平增加,仔猪血清碱性磷酸酶（AKP）活性极显著增加（P＜0.01）,牛血清白蛋白（BSA）抗体水平在免疫后第7天,随日粮锌水平增加而显著降低（P＜0.05）,在第14天则不受影响。研究结果证明,NRC（1998）推荐的锌水平可满足断奶仔猪生长速度和免疫应答的需要。

二日粮锌水平和免疫应激对仔猪生长性能和免疫功能的影响本试验采用2×3因子设计,（1）免疫应激处理（注射大肠杆菌脂多糖或生理盐水）,（2）日粮类型（基础日粮中添加0、60、120mg/kg锌）。在试验的第7天,每日粮处理组随机选取半数仔猪按200μg/kg体重的剂量腹腔注射脂多糖（LPS）,另一半注射同样剂量的生理盐水。试验全期共21天。注射LPS后3h,每个重复选择1头猪采集血清,测定细胞因子白介素1（IL-1）和白介素2（IL-2）浓度。

注射LPS后第2天,每个重复1头猪从前腔静脉采血测定外周血淋巴细胞转化率;另外选1头猪从耳后肌肉注射牛血清白蛋白（BSA）,并于注射后第7和12天从前腔静脉采血,测定血清BSA抗体水平。试验结果表明:LPS刺激显著降低了仔猪注射后周的日增重和采食量（p＜0.01）,但对饲料转化效率无影响。LPS刺激提高了外周血淋巴细胞转化率（p＜0.05）和血清IL-1浓度（p＜0.01）,但未影响血清IL-2浓度和BSA抗体水平。

在LPS刺激后周,随日粮锌水平增加,仔猪日增重有增加的趋势（p＜0.10）,而采食量和饲料转化效率未受影响。随着锌水平提高,淋巴细胞转化率有增加趋势（p＜0.10）。日粮处理没有影响BSA抗体水平、血清IL-1、IL-2浓度。提示经历短期免疫应激的仔猪对锌的需要量要高于健康仔猪。

参考文献

[1]Innate immune activation of swine intestinal epithelial cell lines（IPEC-J2 and IPI-2I）in response to LPS from Salmonella typhimurium[J].C.Arce,M.Ramírez-Boo,C.Lucena,J.J.Garrido.Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases.2008(2)

[2]A diet moderately deficient in zinc induces limited intestinal alterations in weaned pigs[J].J.P.Lallès,C.Favier,C.Jondreville.Livestock Science.2007(1)

[3]MAMMALIAN ZINC TRANSPORTERS[J].Juan P.Liuzzi,Robert J.Cousins.Annual Review of Nutrition.2004

[4]Differential regulation of zinc efflux transporters ZnT-1,ZnT-5 and ZnT-7 gene expression by zinc levels:a real-time RT–PCR study[J].Séverine Devergnas,Fabrice Chimienti,Nadège Naud,AndréPennequin,Yoann Coquerel,Jocelyne Chantegrel,Alain Favier,Michel Seve.Biochemical Pharmacology.2004(4)

[5]孙国君.锌对仔猪及小肠上皮细胞免疫功能的调节作用[D].四川农业大学,2009.