BCA蛋白定量分析试剂盒的应用

背景^[1-3]

BCA蛋白定量分析试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一。BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白质在碱性条件下，可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA（Bicinchoninic acid）试剂结合，最终生成紫色的复合物。该复合物在562 nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。

BCA蛋白定量分析试剂盒

使用方法

1.BCA工作液的配制

（1）BCA工作液总体积的计算：

BCA工作液总体积=（标准品数量+待测样品数量+1）×重复数×200μL。

举例：如果标准品数量为8，待测样品数量1，重复数为3，则BCA工作液总体积=（8+1+1）×3×200μL=6000μL

（2）BCA工作液的配制：按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

举例：将5000μL的BCA试剂A与100μL的BCA试剂B混合，得到5100μL的BCA工作液。

2.BSA标准品的配制

将BSA标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

注：严格的蛋白定量，BSA标准品的稀释溶液应该与待测蛋白样品的溶液相同。但是一般情况下，BSA标准品可以直接用0.9%的NaCl、PBS或者去离子水进行稀释。

3.取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，

注：正常情况下，样品与BCA工作液的体积之比应为1:8。如果样品体积有限，也可使用10μL BSA标准品和待测样品进行检测（即样品与BCA工作液的体积之比为1:20），这时BCA定量试剂盒的检测范围较小为125-2000μg/mL。

4.往每孔中加入200μL的BCA工作液，盖上96孔板盖子。

5.将96孔板放37℃，30分钟。

6.用酶标仪测562 nm处的光吸收值。

应用^[4][5]

用于基于液相色谱质谱联用的结肠癌FFPE组织蛋白组学研究

低温冻存被公认为是组织与器官长期保存的最有效方法之一,其原理是通过降低细胞代谢率保护组织细胞以及细胞组分。但是,由于新鲜标本保存成本较高且复杂,难以在大多数地市级医院病理科开展,及时保存肿瘤组织是病理医师和临床医师开展临床科研工作的基础。

福尔马林固定石蜡包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded,FFPE）是病理科普遍采用的组织处理和保存方法;组织标本经取材、固定、脱水、透明、浸蜡以及包埋等程序处理之后可长时间保存;与新鲜标本不同的是,FFPE组织操作流程简单,易于掌握,可以实现高度自动化处理,而且代价低廉,适合大多数医院病理科开展。因此,FFPE组织已广泛应用于病理科的常规病理临床工作中。与新鲜冰冻组织以及OCT组织相比,尽管FFPE组织具有这么多优势,但是其作为科研的样本劣势也非常明显,其中共价交联、低蛋白溶解率以及低肽段回收率就是目前研究人员难以突破的瓶颈。如何尽早突破该瓶颈显得特别重要。

结肠癌FFPE组织多种蛋白提取缓冲液蛋白提取效率的比较以及蛋白定量方法目的:为了优化临床FFPE组织蛋白的提取效率,进一步为蛋白组学研究质谱分析提供较好的样本,在目前尚缺乏可靠、可重复的FFPE蛋白组学标准样品制备方法的条件下,我们拟寻求一种高效稳健的FFPE组织蛋白提取方法。

方法:基于成本、易用性以及是否适用于质谱分析,选取多种含有一定浓度的非离子、离子去污剂（十二烷基硫酸钠,SDS）和还原剂（二硫苏糖醇,DTT）的蛋白提取缓冲液。这些缓冲液成份经过一定的改良,使组织的溶解度升高,同时,蛋白裂解过程中通过高温孵育以及超声波碎裂等方法以期程度地打开共价键交联。蛋白提取后,采用BCA蛋白定量分析方法以及SDS-PAGE方法检测所提取蛋白的相对浓度,以备下一步使用。

结果:比较了3种含有不同浓度的非离子、离子去污剂SDS和还原剂DTT的蛋白提取缓冲液对结肠癌FFPE组织的蛋白提取效率,BCA检测结果以及SDS-PAGE结果表明含有2%SDS的缓冲液较SDS浓度相对较低的缓冲液具有较高的提取效率。结论:我们通过优化和改良了FFPE组织蛋白提取缓冲液的组成成份和蛋白提取流程,成功从FFPE组织中获得较高浓度的蛋白溶液,并且发现含有相对更高的去污剂SDS的缓冲液具有更高的蛋白提取效率。

参考文献

[1]Search for novel circulating cancer chemopreventive biomarkers of dietary rice bran intervention in ApcMin mice model of colorectal carcinogenesis,using proteomic and metabolic profiling strategies[J].Leonie Norris,Aditya Malkar,Emma Horner‐Glister,Amirmansoor Hakimi,Leong L.Ng,Andreas J.Gescher,Colin Creaser,Stewart Sale,Donald J.L.Jones.Mol.Nutr.Food Res..2015(9)

[2]Colorectal Cancer Initial Diagnosis:Screening Colonoscopy,Diagnostic Colonoscopy,or Emergent Surgery,and Tumor Stage and Size at Initial Presentation[J].Courtney C.Moreno,Pardeep K.Mittal,Patrick S.Sullivan,Robin Rutherford,Charles A.Staley,Kenneth Cardona,Natalyn N.Hawk,W.Thomas Dixon,Hiroumi D.Kitajima,Jian Kang,William C.Small,John Oshinski,John R.Votaw.Clinical Colorectal Cancer.2015

[3]Feasibility of label-free phosphoproteomics and application to base-line signaling of colorectal cancer cell lines[J].Sander R.Piersma,Jaco C.Knol,Inge de Reus,Mariette Labots,Bharath K.Sampadi,Thang V.Pham,Yasushi Ishihama,Henk M.W.Verheul,Connie R.Jimenez.Journal of Proteomics.2015

[4]Label-Free Quantitative Mass Spectrometry Reveals a Panel of Differentially Expressed Proteins in Colorectal Cancer[J].Nai-Jun Fan,Jiang-Ling Gao,Yan Liu,Wei Song,Zhan-Yang Zhang,Chun-Fang Gao,David B.Ordiz.BioMed Research International.2015

[5]周仪华.基于液相色谱质谱联用的结肠癌FFPE组织蛋白组学研究[D].南昌大学,2019.