人胰淀粉酶(PAMY)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人胰淀粉酶(PAMY)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中胰淀粉酶(PAMY)的含量。

实验原理：往预先包被人胰淀粉酶(PAMY)抗体的包被酶标板孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰淀粉酶(PAMY)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人胰淀粉酶(PAMY)ELISA KIT

人胰淀粉酶(PAMY)ELISA kit操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于sDR5-Fc对大鼠重症急性胰腺炎模型治疗作用研究

通过建立大鼠SAP模型,探讨s DR5-Fc对大鼠重症急性胰腺炎模型是否有治疗作用。

方法:25只雄性SD大鼠,6-8周龄,200-220g,,大鼠的皮肤及毛发完整,肢体反应较敏捷。模型建立前1周,在普通清洁级动物房适应性饲养,动物房环境要求:温度为20-25℃、湿度为50±10%、光照/暗循环时间为12小时、通风良好、能够给予足够的饮水和饲料供应、保证每间隔2-3天更换一次垫料,饲料、饮水、饲养笼子及垫料均经过高压灭菌。

饲养期间大鼠无疾患及死亡,生存状态良好。随机分为5组:正常组、模型组、Ig G组、低剂量s DR5-Fc组、高剂量s DR5-Fc组,每组5只。对照组（NC组）:间隔1小时分2次腹腔注射0.9%生理盐水;模型组（SAP组）:间隔一小时分两次腹腔注射10%L-精氨酸（300mg/kg）建立大鼠SAP模型;Ig G组:SAP模型建立成功30min后,经鼠尾静脉给予注射Ig G;低剂量s DR5-Fc组（Dex-L组）:SAP模型建立成功30min后,经鼠尾静脉给予注射剂量为7.5mg/kg的s DR5-Fc;高剂量s DR5-Fc组（Dex-H组）:SAP模型建立成功30min后,经鼠尾静脉给予注射剂量为15mg/kg的s DR5-Fc。

最后一次注射完L-精氨酸溶液后开始计时为造模成功时间,建模后24小时后,大鼠颈动脉取血,一部分全血采用全自动血液细胞分析仪检测白细胞计数（WBC）,一部分放入绿色肝素抗凝管后3000rpm,4℃,离心10min,小心吸取上清液,分装在EP管内,分离制作血清,每管血清量>200ul,采用全自动生化分析仪检测C-反应蛋白（CRP）、血清淀粉酶（AMY）、胰淀粉酶（PAMY）、脂肪酶（LIP）、血钙水平。

结果:（1）成功建立大鼠重症急性胰腺炎模型;

（2）通过动物血液细胞分析仪测定大鼠WBC水平,发现Ig G组和SAP组较NC组明显升高（p<0.05）,Ig G组和SAP组WBC水平无明显差异（p>0.05）,与SAP组比较,Dex-L组、Dex-H组WBC水平明显下降（p<0.05）,Dex-H组下降更加明显（p<0.05）;

（3）通过全自动生化分析仪测定大鼠AMY、PAMY、LIP、CRP,发现Ig G组和SAP组较NC明显升高（p<0.05）,Ig G组和SAP组AMY、PAMY、LIP、CRP水平无明显差异（p>0.05）与SAP组比较,Dex-L组、Dex-H组AMY、PAMY、LIP、CRP水平明显下降（p<0.05）,Dex-H组下降更加明显（p<0.05）。

参考文献

[1]Enteral nutrition provided within 48 hours after admission in severe acute pancreatitis:A systematic review and meta-analysis[J].Jianbo Song,Yilong Zhong,Xiaoguang Lu,Xin Kang,Yi Wang,Wenxiu Guo,Jie Liu,Yilun Yang,Liying Pei.Medicine.2018(34)

[2]Thoracic Epidural Analgesia and Mortality in Acute Pancreatitis:A Multicenter Propensity Analysis[J].Matthieu Jabaudon,Nouria Belhadj-Tahar,Thomas Rimmelé,Olivier Joannes-Boyau,Stéphanie Bulyez,Jean-Yves Lefrant,Yannick Malledant,Marc Leone,Paer-Selim Abback,Fabienne Tamion,HervéDupont,Brice Lortat-Jacob,Philippe Guerci,Thomas Kerforne,Raphael Cinotti,Laurent Jacob,Philippe Verdier,Thierry Dugernier,Bruno Pereira,Jean-Michel Constantin.Critical Care Medicine.2018(3)

[3]American Gastroenterological Association Institute Guideline on Initial Management of Acute Pancreatitis[J].Seth D.Crockett,Sachin Wani,Timothy B.Gardner,Yngve Falck-Ytter,Alan N.Barkun,Seth Crockett,Yngve Falck-Ytter,Joseph Feuerstein,Steven Flamm,Ziad Gellad,Lauren Gerson,Samir Gupta,Ikuo Hirano,John Inadomi,Geoffrey C.Nguyen,Joel H.Rubenstein,Siddharth Singh,Walter E.Smalley,Neil Stollman,Sarah Street,Shahnaz Sultan,Santhi S.Vege,Sachin B.Wani,David Weinberg.Gastroenterology.2018(4)

[4]Human Pancreatic Acinar Cells[J].Aurelia Lugea,Richard T.Waldron,Olga A.Mareninova,Natalia Shalbueva,Nan Deng,Hsin-Yuan Su,Diane D.Thomas,Elaina K.Jones,Scott W.Messenger,Jiayue Yang,Cheng Hu,Ilya Gukovsky,Zhenqiu Liu,Guy E.Groblewski,Anna S.Gukovskaya,Fred S.Gorelick,Stephen J.Pandol.The American Journal of Pathology.2017(12)

[5]刘洪豪.sDR5-Fc对大鼠重症急性胰腺炎模型治疗作用[D].河南大学,2020.