人宫颈癌组织源细胞的应用

背景^[1-3]

人宫颈癌组织源细胞分离自人宫颈癌组织纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，由人类乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus，简称HPV）引起的，按病理组织学主要分为腺癌、腺角化癌和鳞状细胞癌。宫颈癌细胞呈上皮样，贴壁生长，具有无限增殖能力，丧失接触抑制现象，癌细胞间粘着性减弱。此外，易于被凝集素凝集，细胞骨架结构发生紊乱。

人宫颈癌组织源细胞

细胞分离方法：

1.将宫颈癌组织至于无菌的培养皿中用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至无明显血细胞；

2.剪取宫颈癌组织边缘微血管丰富的组织，用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗两次；

3.将剪取的宫颈癌边缘*成2-3mm3大小，加入含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗；

4.用进行过灭菌处理的玻璃滴管将剪碎的组织块和清洗用的1×PBS（pH=7.4）一起转入15ml离心管中；

5.250rpm/min离心2 min，小心倾去液体，再加入适量的含双抗的1×PBS（pH=7.4），用玻璃滴管吹吸液体以清洗组织块；

6.继续250rpm/min离心2 min，小心倾去液体，重复上述步骤若干次，直至离心后的液体中观察不到明显的红色；

7.将清洗好的组织块重新转至无菌的培养皿中，用无菌的200 ml的吸头将组织块贴于25cm2培养瓶中；

8.加入2ml培养基，将培养瓶倒置放于37℃、5%CO2的培养箱中2-3h之后正置培养瓶继续培养；

9.培养若干天后，可观察到组织块周围陆续有细胞爬出，继续培养几天，直至组织块周围的细胞达到较高密度（培养其间两天换液一次，换液操作时动作一定要轻柔，以防组织块被摇下）；

10.当组织块附近的细胞生长到较高密度后，将贴壁的组织块吹下，换新的培养基继续培养24；

11.24h后，用0.25%的Trypsin-EDTA消化细胞，FBS中止消化，将消化后的细胞悬液转入15ml离心管，1000rpm/min离心5min，之后倾去废液，用培养基重悬细胞，转入原来的培养瓶中，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

应用^[4][5]

用于冬凌草甲素诱导肿瘤细胞死亡的机制研究

对冬凌草甲素体外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究，主要阐述了冬凌草甲素在三种肿瘤细胞：人黑色素瘤A375-82细胞，人宫颈癌HeLa细胞，小鼠纤维瘤L929细胞中诱导细胞死亡的不同机制。

在测定了三种来源血液的肿瘤细胞（人红白血病细胞系，K562；人组织淋巴瘤细胞，U937；人早幼粒白血病细胞，HL-60）和人黑色素瘤细胞，A375-S2；人宫颈癌细胞，HeLa；人乳腺癌细胞，MCF-7；小鼠纤维肉瘤细胞，L929细胞毒时发现三种血液系统的瘤株均对冬凌草甲素敏感，半数抑制浓度分别为：IC50（K562）：16.2±1.2μmol/L，IC50（U937）：27.1±2.3/μmol/L，IC50（HL-60）：20.4±3.6μmol/L，另外三种人源细胞中以A375-S2细胞最敏感，IC50：15.1±1.2μmol/L，对其中鼠源细胞L929较敏感，IC50：35.6±4.2/μmol/L。

冬凌草甲素在对敏感细胞株有效浓度下作用于人外周血单核细胞（PBMC）12 h，没有细胞毒作用，但随着浓度的增加，对PBMCs具有较弱的细胞毒作用。

在A375-S2细胞实验中，Hoechst 33258荧光染色后证明34.3μmol/L冬凌草甲素作用细胞12 h时出现明显的凋亡小体，DNA电泳则表明大剂量的冬凌草甲素（137.4μmol/L）作用细胞12 h时出现坏死特有的弥散泳带。

采用流式细胞术及LDH活力测定进一步证明冬凌草甲素诱导A375-S2细胞死亡是平衡于凋亡与坏死之间。合适剂量的冬凌草甲素诱导细胞凋亡。