人Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定人血清,血浆及相关液体标本中人Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)的水平。

原理：用纯化抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入抗体，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品浓度。

人Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA KIT

实验步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于牙周治疗前后龈沟液中Ⅰ型胶原羧基端肽及钙卫蛋白的研究

通过检测龈沟液中这两种成分的含量在牙周基础治疗前后的变化探讨它们作为牙周炎诊断和疗效评价的生化指标的可行性。

方法：选取14例慢性牙周炎患者作为实验组,8例健康人作为对照组，每人选择2颗磨牙的单个邻面位点为研究对象。采用吸潮纸尖收集治疗前、基础治疗1周后同一位点及健康牙的龈沟液,称取龈沟液的重量,记录牙龈指数、牙周袋深度、附着丧失水平,采用ELISA法检测龈沟液中ICTP和S100A8/A9的浓度,分别对三组结果及临床指标进行统计学分析。

结果：1.牙周炎组治疗前龈沟液中ICTP、S100A8/A9浓度分别大于对照组浓度,差别具有统计学意义（P<0.01）。

2. 治疗前龈沟液中ICTP、S100A8/A9浓度与牙龈指数、牙周袋深度、附着丧失均呈正相关关系（P<0.05）。

3. 经基础治疗1周后,龈沟液中ICTP、S100A8/A9浓度较治疗前明显降低,但仍高于对照组,差别具有统计学意义（P<0.01）。

4. 牙周炎组治疗后牙龈指数、牙周袋深度、附着丧失均小于治疗前,差别具有统计学意义（P<0.01）。

5.治疗前、后龈沟液中ICTP与S100A8/A9的浓度均呈线性正相关关系（P<0.01）。

参考文献

[1]Myeloid‐related protein（MRP8/14）expression in gingival crevice fluid in periodontal health and disease and after treatment[J].E.Andersen,I.M.Dessaix,T.Perneger,A.Mombelli.Journal of Periodontal Research.2010(4)

[2]Calprotectin,a leukocyte protein related to inflammation,in gingival crevicular fluid[J].Jun‐ichiKido,TeruoNakamura,ReikoKido,KeijiOhishi,NoriyukiYamauchi,MasatoshiKataoka,ToshihikoNagata.Journal of Periodontal Research.2010(7)

[3]Oral Fluid–Based Biomarkers of Alveolar Bone Loss in Periodontitis[J].JANET S.KINNEY,CHRISTOPH A.RAMSEIER,WILLIAM V.GIANNOBILE.Annals of the New York Academy of Sciences.2007(1)

[4]Relationship between C‐telopeptide pyridinoline cross‐links（ICTP）and putative periodontal pathogens in periodontitis[J].Michael D.Palys,Anne D.Haffajee,Sigmund S.Socransky,William V.Giannobile.Journal of Clinical Periodontology.2005(11)

[5]薛婷.牙周治疗前后龈沟液中Ⅰ型胶原羧基端肽及钙卫蛋白的研究[D].山东大学,2014.