植物胰蛋白酶抑制剂(TRASYLOL) ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物胰蛋白酶抑制剂(TRASYLOL)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测样本中植物胰蛋白酶抑制剂(TRASYLOL)的含量。

原理：往预先包被植物胰蛋白酶抑制剂（Trasylol）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物胰蛋白酶抑制剂（Trasylol）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

植物胰蛋白酶抑制剂(TRASYLOL) ELISA试剂盒

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及植物表达载体构建研究

应用基因工程手段，克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因，构建了高效的反义表达载体和RNAi表达体系。通过农杆菌介导法和花粉管通道法将其导入大豆，以期抑制大豆胰蛋白酶抑制剂基因的表达。

取得如下结果：1．利用SDS法和CTAB法从3个品种大豆幼嫩叶子中分离出总基因组DNA，参照Genbank中已知的kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因序列和ATG起始位点，设计合成了两段5’端含有限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸引物，以总DNA为模板，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增得到长度约为670bp的KSTI3 DNA片段。

2．将由大豆品种“美引一号”扩增的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒。重组质粒经大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，得到5个白斑，2个蓝斑。提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定，结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交大连宝生物公司测序并进行BLAST分析。结果表明所克隆的插入片段长为667bp，与预期设计的大小一致，有3个碱基的差异，相似性达到99.54％。

3．将重组质粒和植物表达载体pBI121经限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，通过T4 DNA连接酶，将大豆胰蛋白酶抑制剂基因片段反向插入到pBI121 35S启动子下，构建植物表达载体pBIantiKSTI3。酶切鉴定得知KSTI3基因已成功地反向插入到植物表达载体中。

4．将重组质粒和植物表达载体pBI121经限制性内切酶双酶切，通过T4 DNA连接酶，将大豆胰蛋白酶抑制剂基因反义+正义片段插入到pBI121 35S启动子下，构建RNAi表达载体pBIKSTI3。将该RNAi表达载体pBIKSTI3转入大肠杆菌感受态细胞中增殖培养后提取质粒，再利用冻融法将该表达质粒转入根癌农杆菌EHA105和LBA4404中，得到含pBIKSTI3的菌株。

5．利用农杆菌介导法将含pBIKSTI3质粒的菌株转化大豆，同时用未转化的大豆作阴性对照。转化的大豆子叶节共培养3天后，转入含有Kan和Cef、Carb抗生素的选择培养基上进行筛选培养，结果获得2株转化的再生植株。

发现菌液（OD值）在0.5-0.6之间，侵染26min时效果，且EHA105的转化效率高于LBA4404。对2株再生植株进行PCR检测，以35S启动子和终止子中的一对序列为引物，未转化的植株作为阴性对照，结果从2棵植株中得到2100bp的特异性扩增条带，而未转化的植株中无该片段的产生。

通过花粉管通道法将克隆的KSTI3基因RNAi表达载体导入大豆，获得T0代转化的籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，进行PCR扩增，结果从3棵植株中得到2100bp的特异性扩增条带，而未转基因的植株中无该片段的产生。

参考文献

[1]The effect of drying on unsaturated fatty acids and trypsin inhibitor activity in soybean[J].O.J Stewart,G.S.V Raghavan,V Orsat,K.D Golden.Process Biochemistry.2003(4)

[2]Glycolysis modulates trypanosome glycoprotein expression as revealed by an RNAi library[J].James C.Morris,Zefeng Wang,Mark E.Drew,Paul T.Englund.The EMBO Journal.2002(17)

[3]Applications of antisense and siRNAs during preclinical drug development[J].James D Thompson.Drug Discovery Today.2002(17)

[4]On the Role of RNA Amplification in dsRNA-Triggered Gene Silencing[J].Titia Sijen,Jamie Fleenor,Femke Simmer,Karen L.Thijssen,Susan Parrish,Lisa Timmons,Ronald H.A.Plasterk,Andrew Fire.Cell.2001(4)

[5]吕品.大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及植物表达载体构建[D].吉林农业大学,2007.