大鼠FK506结合蛋白4(FKBP4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠FK506结合蛋白4(FKBP4)ELISA试剂盒 是利用固相夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中FK506结合蛋白4(FKBP4)的含量。

检测原理：已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

大鼠FK506结合蛋白4(FKBP4)

操作步骤：

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于FKBP12在细胞程序性坏死及其介导的全身炎症反应综合征中的调控作用研究

研究并鉴定FKBP12在细胞程序性坏死中的调控作用和机制,并探讨FKBP12在细胞程序性坏死相关疾病中的作用,从而鉴定调控细胞程序性坏死的新靶点,为细胞程序性坏死相关疾病的治疗提供参考。

研究方法：（1）通过透射电镜分析细胞死亡的形态特征、Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞死亡类型和比例,鉴定TNFα诱导的L929和HT22细胞死亡方式。

（2）利用显微镜直接观察法、台盼蓝拒染法及流式细胞术测定PI染色阳性细胞比例的方法检测TNFα诱导的细胞程序性坏死。通过慢病毒介导的基因敲入和敲低技术,构建稳定过表达或敲低FKBP12的细胞系,并结合FKBP12配体药物,鉴定FKBP12对细胞程序性坏死的调控作用。

（3）利用TNFα与CHX联合诱导的NIH/3T3细胞死亡模型,研究FKBP12敲低对细胞凋亡的影响。

（4）利用免疫沉淀和Western blot技术检测RIPK1和RIPK3的相互结合,同时利用Duolink in situ PLA技术体系配合激光共聚焦显微镜观察对RIPK1与RIPK3结合形成坏死复合体进行验证。

（5）利用NuPAGE（?）electrophoresis system技术体系和Duolink in situ PLA技术体系检测RIPK1、RIPK3及MLKL蛋白同源分子间的相互作用。

（6）利用Real-time PCR或Western blot技术对FKBP12敲低或过表达效果进行验证,同时,Western blot也用于检测其他蛋白的表达或磷酸化水平变化,并配合细胞成份分离技术检测蛋白质的亚细胞定位。

参考文献

[1]RIP kinase 1–dependent endothelial necroptosis underlies systemic inflammatory response syndrome[J].Matija Zelic,Justine E Roderick,Joanne A O’Donnell,Jesse Lehman,Sung Eun Lim,Harish P Janardhan,Chinmay M Trivedi,Manolis Pasparakis,Michelle A Kelliher.Journal of Clinical Investigation.2018(5)

[2]Sensing of viral and endogenous RNA by ZBP 1/DAI induces necroptosis[J].Jonathan Maelfait,Layal Liverpool,Anne Bridgeman,Katherine B Ragan,Jason W Upton,Jan Rehwinkel.The EMBO Journal.2017(17)

[3]FK506-Binding Proteins and Their Diverse Functions[J].Mingming Tong,Yu Jiang.Current Molecular Pharmacology.2016(1)

[4]Holding RIPK1 on the ubiquitin leash in TNFR1 signaling[J].Nieves Peltzer,Maurice Darding,Henning Walczak.Trends in Cell Biology.2016

[5]王籽橙.FKBP12在细胞程序性坏死及其介导的全身炎症反应综合征中的调控作用研究[D].军事科学院,2019.