人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）特异性检测样本中表面活性蛋白A(SP-A)的含量。

实验原理：往预先包被人表面活性蛋白A(SP-A)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人表面活性蛋白A(SP-A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于肺表面活性物质相关蛋白C和A原核表达载体的构建、表达及纯化研究

通过评价羊水或痰液中肺表面活性物质成分的肺表面活性或物理效应来判断肺成熟度,包括泡沫振荡实验、荧光偏振评价FLM、分光光度计、LB计数等；卵磷脂／鞘磷脂（L/S）测定、磷脂酰甘油（PG）测定生物化学方法操作复杂,需时长,容易受羊水血性污染的影响,使用受到一定的限制。

生物物理学方法除泡沫振荡实验（主观性太强）外,其他均需要特定的仪器设备,且在羊水受到血液或阴道分泌物污染时,准确率差；由于以上方法的不同缺陷,故目前建立一种非常简便、准确,可被大家广泛接受并应用的肺成熟度检测方法,仍是探索的热点。

SP-A含量的检测对于上述多种疾病的诊断和预后具有很大的价值。杜风兰等研究脐血SP-A水平与羊水SP-A水平的相关性,证明脐血可以代替羊水SP-A中水平作为胎肺成熟度的标志,利用westernblot方法,得到斑点杂交结果后用凝胶图象分析系统测定NC膜上各点的相对灰度值,根据标准蛋白相对灰度值曲线,求得待测标本SP-A的实际含量,尚无法达到精确测定的标准。

Yoshio Kuroki等利用双抗体夹心ELISA检测样本中SP-A,检测范围10～1280ng。此后,以SP-A单克隆抗体为基础的双抗体夹心ELISA技术被广泛应用于SP-A的检测,在SP-A的研究中发挥了重要的作用。

Koji Kaneko等人通过检测24h内新生儿脐带血及外周血中SP-A含量预测新生儿呼吸窘迫综合症的发生,确定SP-A是预测胎儿肺成熟度的重要标志。对于肺表面活性物质蛋白SP-C来说,目前主要的检测方法为通过基因检测的方法了解其基因突变位点,从而确定诊断。

多数SFTPC基因突变患者存在其SP-C蛋白表达量异常,由于基因诊断价格昂贵,而且耗时较长,可通过检测SP-C蛋白有无变化进行筛查,从而提高预测肺间质性疾病的效率。

参考文献

[1]Pulmonary collectins play distinct roles in host defense against Mycobacterium avium.[J].Ariki Shigeru,Kojima Takashi,Gasa Shinsei,Saito Atsushi,Nishitani Chiaki,Takahashi Motoko,Shimizu Takeyuki,Kurimura Yuichiro,Sawada Norimasa,Fujii Nobuhiro,Kuroki Yoshio.Journal of immunology（Baltimore,Md.:1950）.2011(5)

[2]Surfactant protein A modulates the lipopolysaccharide-induced inflammatory response related to preterm birth[J].Annamari Salminen,Reetta Vuolteenaho,Reija Paananen,Marja Ojaniemi,Mikko Hallman.Cytokine.2011(2)

[3]Lung effector memory and activated CD4+T cells display enhanced proliferation in surfactant protein A-deficient mice during allergen-mediated inflammation.[J].Pastva Amy M,Mukherjee Sambuddho,Giamberardino Charles,Hsia Bethany,Lo Bernice,Sempowski Gregory D,Wright Jo Rae.Journal of immunology（Baltimore,Md.:1950）.2011(5)

[4]Combined and Independent Action of Proteins SP-B and SP-C in the Surface Behavior and Mechanical Stability of Pulmonary Surfactant Films[J].David Schürch,Olga L.Ospina,Antonio Cruz,Jesús Pérez-Gil.Biophysical Journal.2010

[5]王静.肺表面活性物质相关蛋白C和A原核表达载体的构建、表达及纯化[D].南方医科大学,2012.