聚糖邻氨基吡啶(2-AP)荧光标记试剂盒的应用

背景^[1-3]

聚糖邻氨基吡啶(2-AP)荧光标记试剂盒适用于各种寡聚糖的标记研究。

聚糖邻氨基吡啶(2-AP)荧光标记是一种旨在通过荧光探针对聚糖邻氨基吡啶(2-AP)和还原性糖分子的末端羧基碳的结合，进而化学还原而产生的标记糖分子，来识别和定量糖分子成分和丰度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种寡聚糖的标记制备。

聚糖邻氨基吡啶(2-AP)荧光标记试剂盒

聚糖（glycan）是一种缺乏可见光或紫外光吸收特性的生物大分子，因此使用相应的标记分子成为聚糖分子敏感定量检测分析所必需。运用还原性氨基反应化学（amination chemistry），将释放出的聚糖分子游离还原末端，标记上荧光探针，以达到纯化分离、识别和定量的目的。对氨基苯甲酰胺（2-aminobenzamide；2-AB）是一种荧光标记分子，分子量为136.15，具有紫外（330nm波长）吸收性和荧光特性（激发波长320nm，散发波长420nm）。

在标记糖分子中，为非特异性，超敏感（皮摩尔级）、确保糖分子结构完整性和稳定性。标记效率可达85%。首先糖分子处于一种还原形态，染料的胺基团与糖分子的羧基碳之间反应，产生亲核性schiff碱配体结构。然后通过化学还原剂进行还原，而获得标记。

应用^[4][5]

用于癌细胞中端粒酶活性检测方法的应用研究

端粒酶是由人端粒酶逆转录酶催化亚基组成的蛋白质复合物,该复合物以自身的RNA组分为模板,在染色体末端添加TTAGGG重复序列。

端粒酶活性可在大多数原发性人类肿瘤标本和肿瘤衍生细胞系中检测到。大多数正常的人类细胞缺乏端粒酶活性,端粒随着细胞分裂而缩短,直到无法缩短而凋亡,除了在少数增殖细胞中表达,如生殖细胞和干细胞。在大多数永生细胞和癌细胞中,核糖核蛋白端粒酶通过在染色体末端添加TTAGGG重复序列来维持端粒长度,使细胞分裂过程中的DNA损伤得到修复并使细胞可以无限增殖,甚至永生。端粒酶的维持机制是无限复制潜力的基础,是癌症诊断的生物标志物。

端粒酶的有效检测对生物学和疾病诊断等方面具有重要的意义。因此,端粒酶的特异性、准确性及灵敏性检测极具前瞻性。

为了更好地测定人类恶性肿瘤中端粒酶的生物学意义和临床意义,需要对端粒酶活性进行准确的检测。本文采用无淬灭分子信标标记的二次信号放大策略超灵敏检测端粒酶的方法,利用端粒酶的存在可以催化端粒重复单位（TTAGGG）n添加到端粒酶底物链的3’末端,产生端粒重复的端粒酶延伸产物。

随着DNA聚合酶的加入,引物沿着模板延伸取代端粒酶延伸产物形成双链。同时,双链中2-AP分子信标单链可以被T7外切核酸酶降解,释放游离的2-AP分子和引物延伸链,而引物延伸链由于5’端磷酸化而保留。

自由引物延伸链可以与另外的2-AP分子链结合形成新的双链,被T7外切酶循环降解,释放大量游离的2-AP分子,从而产生明显增强的荧光信号。

通过将荧光分子探针与DNA结合,使其荧光被高度淬灭,而端粒酶的存在可以促使靶标特异性二次信号放大,增强荧光信号。该实验设计简约、步骤简单、操作容易,实验过程中使用荧光检测技术,实现了对端粒酶活性的超灵敏检测。

参考文献

[1]A simple and sensitive fluorescence method for detection of telomerase activity using fusion protein bouquets[J] . Tao Wu,Yuanfu Zhang,Tingting Hou,Yinghong Zhang Shuhao Wang.  Analytica Chimica Acta . 2018

[2]Clinical utility of EZH1 mutations in the diagnosis of follicular-patterned thyroid tumors[J] . Chan Kwon Jung,Yourha Kim,Sora Jeon,Kwanhoon Jo,Sohee Lee,Ja Seong Bae.  Human Pathology . 2018

[3]A highly sensitive and facile graphene oxide-based nucleic acid probe: Label-free detection of telomerase activity in cancer patient’s urine using AIEgens[J] . Xiaowen Ou,Fan Hong,Zhenyu Zhang,Yong Cheng,Zujin Zhao,Pengcheng Gao,Xiaoding Lou,Fan Xia,Shutao Wang.  Biosensors and Bioelectronics . 2017

[4]Exonuclease I manipulating primer-modified gold nanoparticles for colorimetric telomerase activity assay[J] . Lei Zhang,Sijin Zhang,Wei Pan,Qingcheng Liang,Xingyu Song.  Biosensors and Bioelectronics . 2016

[5]王婷婷. 癌细胞中端粒酶活性检测方法的应用研究[D].山东师范大学,2020.