表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人表皮生长因子受体（EGFR）水平。

实验原理：用纯化的人表皮生长因子受体（EGFR）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人表皮生长因子受体（EGFR），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人表皮生长因子受体（EGFR）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人表皮生长因子受体（EGFR）含量。

表皮细胞生长因子受体(EGFR)ELISA试剂盒

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于EGF、EGFR、bFGF及PCNA的表达特征及其与复发性阿弗他溃疡发生关系的实验研究

研究EGF、EGFR与bFGF等细胞因子及其受体的蛋白和基因在口腔溃疡组织中的表达规律以及这种表达与溃疡发生的关系，探讨口腔溃疡发病的相关机制。

方法：8例复发性口腔溃疡（RAU）和6例正常口腔粘膜手术切除后，去除粘膜下组织。用免疫组织化学方法研究EGF、EGFR、bFGF等细胞因子蛋白和PCNA在复发性口腔溃疡及正常口腔粘膜组织中的表达特征和分布规律；用RT-PCR技术检测口腔溃疡及正常粘膜组织中EGF、EGFR、bFGF和β-actin基因的表达水平。

结果：光镜下见RAU病变组织中上皮结构基本消失，大量炎性细胞浸润，其中以中性粒细胞和淋巴细胞为主。免疫组织化学显示PCNA在正常口腔粘膜中主要分布于基底层细胞的细胞核内，在RAU组织中表达呈散在分布，主要位于残余上皮细胞的细胞核内，表达量较正常粘膜明显减少。

EGF在正常口腔粘膜中主要分布于基底层细胞和棘层细胞中，阳性表达出现在胞浆中，RAU组织中EGF表达量明显减少（P＜0.05）。EGFR在正常粘膜和RAU中均有表达，在正常粘膜中EGFR阳性表达主要定位于基底层细胞的胞浆和胞膜上，在RAU中该蛋白表达明显减少（P＜0.05）。

bFGF在正常口腔粘膜的阳性表达主要见于粘膜上皮基底细胞层的细胞外基质及固有层的成纤维细胞；bFGF在RAU组织内主要由免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞表达，表达量较正常粘膜明显增加（P＜0.05）。在正常口腔粘膜和溃疡组织中，EGF、EGFR和bFGF基因都有表达。

参考文献

[1]Epidermal growth factor receptor signaling activates met in human anaplastic thyroid carcinoma cells.Bergstrom JD,Westermark B,Heldin NE.Experimental Cell Research.2000

[2]Uptake and transport of epidermal growth factor by the small intestinal epithelium of the fetal rat.Weaver LT,Gonnella PA,Israel EJ,et al.Gastroenterology.1990

[3]Cross-talk between epidermal growth factor receptor and protein kinase C during calcium-induced differentiation of keratinocytes.Denning M F,Dlugosz A A,Cheng C,et al.Experimental Dermatology.2000

[4]Assessment of epidermal growth factor in oral secretions of patients receiving radiation therapy for cancer.Epstein J B,Emerton S,Guglietta A,et al.Oral Oncology.1997

[5]孙鹏.EGF、EGFR、bFGF及PCNA的表达特征及其与复发性阿弗他溃疡发生关系的实验研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2003.