大鼠解整合素样金属蛋白酶9(ADAM9)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠解整合素样金属蛋白酶9(ADAM9)ELISA KIT可同时检测天然或重组的大鼠ADAM9,且与其他相关蛋白无交叉反应，用于ELISA法定量测定大鼠血清,血浆,细胞培养上清或其它相关生物液体中ADAM9含量。

实验原理：用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗ADAM9抗体的微孔中依次加入标本或标准品,生物素化的抗ADAM9抗体,HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的ADAM9呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

大鼠解整合素样金属蛋白酶9(ADAM9)ELISA KIT

操作步骤：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于ADAM9调控肝癌细胞放射敏感性的相关研究

通过慢病毒感染降低或过表达肝癌细胞的ADAM9蛋白,观察经X线照射后肝癌细胞的细胞增殖、克隆形成、裸鼠皮下成瘤等细胞生物学行为的变化以及相关蛋白的表达,探讨ADAM9与肝癌细胞放射敏感性的关系,为增强肝癌放疗敏感性寻找新的分子靶点提供理论支持。

方法:分别构建ADAM9蛋白过表达和敲除的慢病毒载体。将ADAM9敲除慢病毒载体转染至肝癌细胞株MHCC97H,并与空载组形成对照;并且同理将ADAM9过表达慢病毒载体转染至肝癌细胞株Huh-7,并与空载组形成对照。

运用Western blot实验验证ADAM9蛋白敲除以及过表达的效果。取敲除或过表达成功的细胞株与其相应的对照组细胞在相同条件下经6MV X线4Gy照射。

运用CCK-8实验检测其细胞增殖能力;运用琼脂克隆形成实验研究其集落形成能力;运用裸鼠皮下成瘤实验探究其生长能力;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及DNA损伤相关蛋白γ-H2AX的表达变化,并进行统计学分析。

结果:1.敲除ADAM9后肝癌细胞株MHCC97H的ADAM9蛋白的表达明显受到了抑制;过表达ADAM9后肝癌细胞株Huh-7的ADAM9蛋白的表达较空载组升高。

2. CCK-8结果显示:与空转组相比,ADAM9蛋白敲除组的肝癌细胞株MHCC97H的细胞增殖明显减少（P<0.01）;肝癌细胞株Huh7的过表达组与空转组相比,ADAM9的细胞增殖明显增多,差异具有统计学意义（P<0.01）;

3.琼脂克隆形成实验发现:ADAM9蛋白敲除组与空转组相比,克隆形成能力减弱,差异具有统计学意义（P<0.01）;过表达组与空转组相比,克隆形成能力增强（P<0.01）。

参考文献

[1]Matrix metalloproteinases in human melanoma.Hofmann UB,Westphal JR,Van Muijen GN,Ruiter DJ.The Journal of Investing.2000

[2]Transmembrane proteases in cell growth and invasion:new contributors to angiogenesis?.Bauvois Brigitte.Oncegene.2004

[3]Genistein enhances the radiosensitivity of breast cancer cells via G2/M cell cycle arrest and apoptosis.Liu X,Sun C,Jin X,et al.Molecules.2013

[4]Vascular endothelial growth factor（VEGF）is an autocrine growth factor for VEGF receptor-positive human tumors.Masood R,Cai J,Zheng T.Blood.2001

[5]姜舒.ADAM9调控肝癌细胞放射敏感性的相关研究[D].青岛大学,2020.