人Β萘酚(Β-NPH)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人Β萘酚(Β-NPH)ELISA试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人Β萘酚(Β-NPH)的含量。

人Β萘酚(Β-NPH)ELISA试剂盒

人Β萘酚(Β-NPH)ELISA试剂盒采用竞争ELISA法。用β-Nph抗原包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的β-Nph与包被的β-Nph竞争生物素标记的抗β-Nph单抗上的结合位点，游离的成分被洗去。

加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色，加终止液后变为黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，β-Nph浓度与OD450值之间呈反比，通过绘制标准曲线计算出样品中β-Nph的浓度。

【操作步骤】

1、取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。

2、分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔，1个空白对照

3、标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0号标准品。

4、加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

5、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

6、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，如此重复5次，拍干。

7、加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

8、温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

9、洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。

10、显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

11、终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。

12、读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于西南地区胡蜂毒的物质类别定性定量分析及主成分分离纯化研究

采用化学显色法、SDS-PAGE特征图谱和分光光度法等技术对采自西南地区胡蜂的蜂毒所含各类物质成分进行鉴别研究和含量测定研究,为分离纯化得到的分子结构鉴定提供参考;采用HPLC分离纯化胡蜂毒中6个色谱纯组分,并利用质谱、核磁共振光谱、蛋白多肽N端测序和C端测序等技术手段对各组分的结构进行解析。

方法采用了茚三酮试验、蛋白黄反应试验和双缩脲反应试验来鉴别胡蜂毒中的氨基酸和多肽蛋白类成分;α-萘酚试验、斐林试验、多糖试验来鉴别本品中糖或苷类成分;采用碘化铋钾试验、碘化汞钾试验、碘-碘化钾试验、硅钨酸试验等鉴别本品中生物碱类成分,碱性β-萘酚等试剂来鉴别本品中的芳胺类成分;利用SDS-PAGE特征图谱检测同一产地不同批次的胡蜂毒的分子量分布;初步研究胡蜂毒的大类化学成分,并进行了相关含量研究:

采用BCA法、福林酚法、考马斯亮蓝法测定胡蜂毒中多肽蛋白类物质含量;茚三酮法测定本品中游离氨基酸含量;

苯酚-硫酸法测定胡蜂毒中的多糖含量;采用制备HPLC技术分离纯化了胡蜂毒的主要成分,并利用现代波谱技术和测序技术完成了各主成分的结构表征。

结果蛋白黄鉴别试验、茚三酮和双缩脲的鉴别试验结果表明本品中可能含有氨基酸和多肽蛋白类物质;α-萘酚鉴别试验、斐林鉴别试验和多糖鉴别试验

参考文献

[1]Delivering wasp venom for cancer therapy[J].Miguel Moreno,Esther Zurita,Ernest Giralt.Journal of Controlled Release.2014

[2]MALDI-TOF-MS for rapid detection of staphylococcal Panton–Valentine leukocidin[J].Fadi Bittar,Zoulikha Ouchenane,Farida Smati,Didier Raoult,Jean-Marc Rolain.International Journal of Antimicrobial Agents.2009(5)

[3]Chromatographic fingerprint analysis and characterization of furocoumarins in the roots of Angelica dahurica by HPLC/DAD/ESI-MS n technique[J].Jie Kang,Lei Zhou,Jianghao Sun,Jian Han,De-An Guo.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2008(4)

[4]MALDI-TOF mass spectrometry[J].Christian Jurinke,Paul Oeth,Dirk Boom.Molecular Biotechnology.2004(2)

[5]陈丹.西南地区胡蜂毒的物质类别定性定量分析及主成分分离纯化[D].大理大学,2017.