(E)-β-金合欢烯的制备

背景及概述^[1][2]

(E)-β-金合欢烯可加氢转化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。(E)-β-金合欢烯具有不含硫、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的生物基化学品。例如，CN101553558A描述了在大肠杆菌中利用含有葡萄糖的培养基通过MEV途径生成(E)-β-金合欢烯。通过微生物法生产(E)-β-金合欢烯需要解决的一个重要问题是葡萄糖的来源问题。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一种重要的葡萄糖来源。具体地，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键联结而成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。例如，棉花的纤维素含量接近100％。纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起。例如一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。

(E)-β-金合欢烯

制备^[2]

步骤1、纤维素酶解液的制备。

称取粒径为20～80目的玉米秸秆100g，加入1.5L甲酸溶液(含有88wt％的甲酸和1wt％的HCl)置于处理罐中。在65℃恒温水浴中反应3h后将反应浆液固液分离。对固体组分再进行氨水处理，处理条件为：氨水浓度15wt％、每千克固体组分所用的氨水的体积为8升、处理温度60℃和反应时间16h。反应结束后将物料固液分离，固体组分用蒸馏水洗涤至pH6～7，烘干，得到预处理后的固态物料。

将所述预处理后的固态物料进行酶促水解，酶解条件包括：温度为50℃、每千克预处理后的固态物料所用缓冲液的体积为20升、缓冲液为pH为4.8的柠檬酸缓冲液(0.15mol/L)、酶促水解所用的酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料30U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料60U。酶解24h后将反应浆液取出，在沸水浴中灭酶10min后进行抽滤。抽滤所得液体组分利用HPLC分析检测，所得纤维素酶解液葡萄糖浓度为38.2g/L。

步骤2、质粒的序列结构。

按照上述载体的使用说明书采用PCR克隆、全基因合成、限制性内切酶酶切和连接等分子生物学操作，首先构建1套MEP代谢路径的质粒，具体包括pDCDE质粒、pFGHII质粒和pFG质粒，接着构建1套MVA代谢路径的质粒，具体包括pMevT质粒、pMBIS质粒和pFG质粒，再构建1个用于替换pFG质粒且插入有Hfq基因的质粒，即pFGH质粒。

步骤3、工程菌株的构建过程。

实验组工程菌株F1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入质粒pDCDE、pFGHII和pFGH。该菌株通过可通过MEP代谢路径合成(E)-β-金合欢烯，同时具有Hfq蛋白的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为F1-1、F1-2和F1-3。

实验组工程菌株F2的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入质粒pMevT、pMBIS和pFGH。该菌株通过可通过MVA代谢路径合成(E)-β-金合欢烯，同时具有Hfq蛋白的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为F2-1、F2-2和F2-3。

对照组工程菌株DF1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入质粒pDCDE、pFGHII和pFG。该菌株通过可通过MEP代谢路径合成(E)-β-金合欢烯，但没有Hfq蛋白的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF1-1、DF1-2和DF1-3。

对照组工程菌株DF2的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入质粒pMevT、pMBIS和pFG。该菌株通过可通过MVA代谢路径合成(E)-β-金合欢烯，但没有Hfq蛋白的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF1-1、DF1-2和DF1-3。

步骤4、利用纤维素制备(E)-β-金合欢烯的方法。

将步骤1得到的纤维素酶解液作为含有单糖的水解产物，用于制备液态发酵原料。每升所述液态发酵原料含有100mL实施例1得到的纤维素酶解液以及10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl和余量的水。液态发酵原料灭菌后待用。

在上述液态发酵原料中添加抗生素(氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度为30mg/L)，然后分别接种步骤3得到的12个克隆，接种密度为200×107个/L。在37℃下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加终浓度为200mg/L的IPTG、终浓度为1g/L的L-阿拉伯糖和20mL正癸烷，在30℃下进行诱导表达以发酵合成(E)-β-金合欢烯。诱导24h后取1mL发酵液进行细胞密度和(E)-β-金合欢烯浓度的检测。

主要参考资料

[1] 雷林洁, 滕亮, 赵欣, 于富生, & 王长虹. (2013). 多伞阿魏挥发油提取工艺及化学成分研究. 中成药, 35(006), 1251-1256.

[2] 彭小冰, 邵进明, 刘炳新, 张丰, 靳凤云, & 吴家红. (2014). 葎草鲜品不同部位的挥发油成分及含量. 贵州农业科学, 42(004), 178-181.

[3] 高岚, 李宝石, 齐崴, 陶志平, 尤生萍, & 李妍等. (2020). 利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法.  CN110964680A.