植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒可以用于体外植物样本苯丙氨酸解氨酶(PAL)的含量检测。

原理：往预先包被抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)ELISA试剂盒操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因克隆、表达分析及品种抗灰霉病研究

以有壳美洲南瓜和裸仁美洲南瓜为试材，进行了种皮PAL基因全长序列的克隆，生物信息学及表达分析，研究了植株不同发育时期不同组织部位PAL酶活和PAL基因的表达特性变化，明确了接种灰霉菌后裸仁美洲南瓜植株各个部位防御酶活性变化及其与PAL基因表达水平之间的关系。

结果：1.利用RT-PCR技术，克隆获得了有壳美洲南瓜（P3，P5）和裸仁美洲南瓜（P13，P15）种皮PAL基因的cDNA片段。分析结果表明P3、P13、P5、P15的PAL基因核苷酸和氨基酸序列与其他植物中已分离的PAL基因有很高的同源性，其氨基酸序列具有PAL-HAL功能域和酶活性中心特征序列（GTITASGDLVPLSYIA），同属于LyaseILike超家族。有壳和裸仁美洲南瓜种皮PAL基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比对结果显示P3和P13有25个核苷酸位点发生变异，15个位点氨基酸发生变化。P5和P15发生变异的核苷酸位点有20个，P15编码的氨基酸序列的中间部分与P5编码的氨基酸序列完全一致。

2. 克隆获得裸仁美洲南瓜（P13）种皮PAL基因的全长序列。将该基因命名为CPL-PAL，序列长为2340bp，含有一个2115bp的ORF，可编码704个氨基酸，分子量为77.38KDa，等电点为6.34。P13种皮PAL基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同黄瓜PAL基因及其氨基酸序列相似性分别为80%和85%。CPL-PAL包含PAL-HAL、PLN02457及pheamlyase三个结构域，属于LyaseILike超家族。CPL-PAL蛋白不具有导肽及信号肽，为非跨膜蛋白，可能定位于细胞质、内质网及叶绿体上，为亲水性蛋白。系统进化树表明P13种皮PAL基因和黄瓜PAL基因的亲缘关系最近。三级结构分析可知CPL-PAL蛋白以α-螺旋为主要结构元件，β-转角和无规卷曲较少。

3. 在整个种皮发育过程中，PAL基因在裸仁美洲南瓜（P13，P15）中的相对表达量均低于其在有壳美洲南瓜（P3，P5）中的相对表达量。PAL基因在P3和P13种皮发育中的呈现相反对应的变化趋势，P3中PAL基因在自交授粉后20d后表达量增加，P13中20d后表达量则下降。有壳和裸仁美洲南瓜PAL基因在叶、茎、根、花瓣中均有表达，其中在叶和花瓣中的相对表达量均较高。有壳美洲南瓜植株不同组织部位PAL酶活及PAL基因的相对表达量在整个生育期均高于裸仁美洲南瓜，叶、茎、根中PAL的酶活性与其对应组织部位的PAL基因的表达量存在协同增加的趋势，均在开花期达到峰值。

参考文献

[1]Cloning,Characterization and Functional Analysis of a Phenylalanine Ammonia-lyase Gene（FtPAL）from Fagopyrum tataricum Gaertn[J].Cheng Lei Li,Yue Chen Bai,Hui Chen,Hai Xia Zhao,Ji Rong Shao,Qi Wu.Plant Molecular Biology Reporter.2012(5)

[2]Characterization and primary functional analysis of phenylalanine ammonia-lyase gene from Phyllostachys edulis[J].Z.M.Gao,X.C.Wang,Z.H.Peng,B.Zheng,Q.Liu.Plant Cell Reports.2012(7)

[3]Protein disorder<ce:hsp sp="0.25"/>—<ce:hsp sp="0.25"/>a breakthrough invention of evolution?[J].Avner Schlessinger,Christian Schaefer,Esmeralda Vicedo,Markus Schmidberger,Marco Punta,Burkhard Rost.Current Opinion in Structural Biology.2011(3)

[4]The Language of Calcium Signaling[J].Antony N.Dodd,J?rg Kudla,Dale Sanders.Annual Review of Plant Biology.2010(1)

[5]刘佳.美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因克隆、表达分析及品种抗灰霉病研究[D].甘肃农业大学,2013.