强化梭菌培养基(RCM)的应用

背景^[1-3]

强化梭菌培养基(RCM)用于梭菌的增菌培养和计数。成分(g/L)：蛋白胨10.0牛肉粉10.0酵母粉3.0葡萄糖5.0可溶性淀粉1.0氯化钠5.0醋酸钠3.0L-半胱氨酸盐酸盐0.5琼脂0.5pH值6.8±0.1，25℃厌氧培养。

原理：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母粉、可溶性淀粉和L-半胱氨酸盐酸盐提供碳源、氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；氯化钠维持均衡的渗透压；醋酸钠可抑制革兰氏阴性菌；微量琼脂（0.5g）增加了其还原环境的稳定性，可以防止液体对流，即防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散，有利于厌氧环境的形成；无动力的细菌在此培养基中呈颗粒状或条状生长，可进行计数；有动力的细菌在培养基中通常呈浑浊生长，一般不能计数。

强化梭菌培养基(RCM)

用法：称取本品38.0g,加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中,分装,121℃高压灭菌15分钟,备用。

梭菌属呈细胞杆状，0.3～2.0μm×1.5～2.0μm，常排列成对或短链，圆的或渐尖的末端。通常多形态，幼龄时革兰氏常呈阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆或球形孢囊膨大。大多数种为化能异养菌；有的化能自养菌或无机化能营养。可以水解糖、蛋白质，或两者都无或两者皆有。

它们通常从糖或蛋白胨产生混合的有机酸和醇类。不还原硫酸盐。接触酶通常阴性，专性厌氧，如在空气中生长也是极弱，生孢被抑制。它们的代谢极富多样性，最适温度10～65℃。广泛分布在环境中，许多种可产生外毒素，有的对动物有毒，由于伤口感染或吸收毒素。

应用^[4][5]

用于不同来源的艰难梭菌其毒素、MLST分型及药敏情况的分析研究

对来源于成人和婴幼儿的艰难梭菌菌株进行相应的研究,同时了解这些菌株对目前CDI治疗常用抗菌药物的敏感性及其耐药基因产生的情况。

方法收集有腹泻症状的成人粪便标本675份、及健康婴幼儿（<2岁）粪便标本618份。将新鲜粪便接种于平板培养基上在35℃温箱厌氧孵育48h,挑选可疑菌落进行两次耐氧试验后通过API20A厌氧鉴定条进行鉴定或扩增艰难梭菌16srRNA特异性片段加以鉴定。

16srDNA引物根据NCBI艰难梭菌参考菌株630设计。通过PCR方法鉴定所有菌株毒素基因的tcdA、tcdB。同时对毒素基因阳性的菌株进行MLST分型,根据Griffiths设计的七对看家基因引物测序,将每一份样品中测定的7管家基因序列（adk、atpA等）提交到公用数据库(http://pubmlst.Org/Clostridium difficile中比对,获得相应的等位基因谱,然后将等位基因图谱提交到科克大学的公开数据库（http://mlst.ucc.ie/mlst/）获得ST型,若数据库中不存在的型别认为是新的ST型。

将7个等位基因的序列合并成1个大序列,使用clustalx软件将64个样品的序列进行Alignment对齐,然后在MEGA7.0上使用Maximum likelihood（ML）法构建进化树。将67株含有毒素基因的艰难梭菌厌氧培养48小时候后,挑取若干菌落将浊度调到3.0麦氏单位,用CDAB检测试剂条在全自动免疫荧光分析仪上检测艰难梭菌A/B毒素。

利用测序的方法检测毒素基因tcdA、tcdB的负调控基因tcdC的突变位点,分析突变位点与毒素表达的关系。

同时进行细胞毒素试验：调取三株来源于成人毒素基因和毒素检测都阳性的菌株,与三株来源于儿童毒素基因阳性而毒素表达阴性的菌株,接种到预制好的10ml脑心浸液肉汤中,厌氧环境35℃培养48h,离心过滤取上清感染Vero细胞。

将培养基换成含有1/10菌液上清的培养基,培养箱里孵育1h,用PBS洗三次之后再换成正常的完全培养基,继续培养24小时,次日在显微镜下观察Vero细胞的形态。将待测菌培养48h后每个标本挑取菌液0.5麦氏单位,涂布到提前制备好的布氏琼脂平板上,再贴上Etest条放于厌氧罐中37℃培养48h。

参考文献

[1]Tigecycline for severe Clostridium difficile infection[J].Ashley Thomas,Farhan Khan,Nizam Uddin,Mark R.Wallace.International Journal of Infectious Diseases.2014

[2]Time‐resolved cellular effects induced by TcdA from Clostridium difficile[J].Nelli Jochim,Ralf Gerhard,Ingo Just,Andreas Pich.Rapid Commun.Mass Spectrom..2014(10)

[3]Molecular Epidemiology of Clostridium difficile Infection in a Major Chinese Hospital:an Underrecognized Problem in Asia?[J].Peter M.Hawkey,Clare Marriott,Wen En Liu,Zi Juan Jian,Qian Gao,Thomas Kin Wah Ling,Viola Chow,Erica So,Raphael Chan,Katie Hardy,Li Xu,Susan Manzoor.Journal of Clinical Microbiology.2013(10)

[4]Burden of Clostridium difficile on the Healthcare System[J].Erik R.Dubberke,Margaret A.Olsen.Clinical Infectious Diseases.2012(supp)

[5]陈丽丹.不同来源的艰难梭菌其毒素、MLST分型及药敏情况的分析[D].南方医科大学,2016.