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乙酰辅酶A的应用及发展前景

发布日期:2018/10/11 11:48:05

【概述】[1] [2]

乙酰辅酶A是工业生产上合成胆固醇、 酮体和脂质等许多重要产品的前体物。 在酿酒酵母中,不同的细胞区隔,如线粒体、 胞液和过氧化物酶体中均能产生。 在胞液中,丙酮酸经过丙酮酸脱羧酶、 乙醛脱氢酶、 乙酰辅酶A合成酶的催化作用形成。 乙酰辅酶A合成酶( acetyl coenzyme A synthetase,ACS)基因由ACS1和ACS2两个基因编码[4]。乙酰辅酶A水解酶( acetyl coenzyme A hydrolase,ACH)由ACH1基因编码,催化其水解为乙酸和辅酶A,可参与细胞内调节。

乙酰辅酶 A 是酿酒酵母代谢网络中最重要的代谢中间体,参与细胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核 4 个不同亚细胞结构域的代谢过程 (见图 1) 。乙酰辅酶 A 为脂肪酸合成的底物,同时也是脂肪酸降解的产物。此外,乙酰辅酶 A 为蛋白质乙酰化的前体,对酶功能的调节和 DNA 转录有重要作用。

合成脂肪酸的第一步反应是乙酰辅酶 A 在乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC) 的催化下生成丙二酰辅酶 A,这一步是脂肪酸合成的限速步骤。酿酒酵母存在两个 ACC,定位于细胞质的由 ACC1 编码,定位于线粒体的由 HFA1 编码[17]。酿酒酵母合成甾醇的第一步反应是乙酰乙酰辅酶 A 硫解酶(ERG10)催化两分子乙酰辅酶 A 生成一分子乙酰乙酰辅酶 A,经 MVA 途径生成鲨烯,鲨烯在一系列酶的催化下合成甾醇(见图 1) 。乙酰辅酶 A 可为蛋白质乙酰化提供乙酰基供体。翻译后蛋白的 α ε-氨基酸的乙酰化修饰是原核和真核生物的重要调控方式之一。酿酒酵母主要对各种组蛋白 N-端的赖氨酸残基进行乙酰化修饰或去乙酰化,中和或增加组蛋白的正电荷,使组蛋白与 DNA 分离或结合, 从而调控 DNA 的复制与转录等。 组蛋白乙酰化涉及的乙酰辅酶 A 量级较小,对其代谢流的影响不大。

与其他真核生物类似,酿酒酵母乙酰辅酶 A 代谢高度区域化,无法自由穿梭于不同的细胞器。真核生物中,3 种运输系统具有运输乙酰辅酶 A 的能力,分别为如下。①肉毒碱穿梭系统,胞质或过氧化物酶体的乙酰辅酶 A 被催化为乙酰肉毒碱,然后被转运进入线粒体。然而,酵母并不能从头合成肉毒碱,因此,只有在外源补加肉毒碱的情况下,该系统才会发挥作用。②乙醛酸支路系统,参与乙醛酸循环的苹果酸合酶将胞质乙酰辅酶 A 与乙醛酸催化为苹果酸,苹果酸脱氢再生为草酰乙酸,再与乙酰辅酶 A 生成柠檬酸,构成一个循环。③柠檬酸裂解酶系统,在细胞质中将柠檬酸催化为乙酰辅酶 A。第一种通过肉毒碱穿梭, 后两种通过可自由通过细胞器膜的柠檬酸穿梭,酿酒酵母存在前两种运输系统,目前还未从酿酒酵母中鉴定到 ACL 编码基因。

【制备方法】[2]

酿酒酵母主要通过两个代谢途径产生乙酰辅酶 A。①糖酵解产生并进入线粒体部分的丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH) 催化生成乙酰辅酶 A(图 1) 。PDH 是酿酒酵母最复杂的蛋白复合体之一,由丙酮酸脱氢酶(E1) 、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2) 、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)和 6 种辅因子[二磷酸硫胺(TPP) 、lipoic acid、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 、CoA、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和 Mg2+]构成,PDH 不可逆地催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A,酿酒酵母可从转录和转录后水平对 PDH 复合体进行调控。乙酰辅酶 A 和草酰乙酸在柠檬酸合酶的催化下生成柠檬酸由此开始TCA 循环。 ②保留在细胞质的丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下转化为乙醛, 乙醛在乙醛脱氢酶 (ALD)的作用下生成乙酸, 乙酸和辅酶 A 在乙酰辅酶 A合酶(ACS)的催化下生成乙酰辅酶 A。酿酒酵母存在两个 ACS 编码基因, ACS1 和 ACS2, ACS1的表达受葡萄糖抑制,ACS2 为组成型表达,不受葡萄糖抑制。细胞质中由丙酮酸合成乙酰辅酶 A 的途径也称为丙酮酸脱氢酶支路。1 分子葡萄糖通过丙酮酸脱氢酶支路合成 2 分子乙酰辅酶A,净消耗 2 分子三磷酸腺苷(ATP) 。此外,脂肪酸 β-氧化也可生成乙酰辅酶 A。

【应用及发展前景】[1]

乙酸乙酯是清香型白酒的主体香,一直备受关注。通过基因工程手段提高酿酒酵母分泌乙酰辅酶A的能力,从而提高乙酸乙酯生成量。通过ACH1基因缺失的α5ΔACH1菌株表达发现,乙酰辅酶A含量较亲本菌株α5稍有提高,但对提高乙酸乙酯生成量的效果并不明显,分析原因可能是ACH1基因定位于线粒体中,其增加的是线粒体中乙酰辅酶A的含量,线粒体中的乙酰辅酶A无法流向乙酸乙酯的合成。在ACH1基因缺失的基础上,过表达ACS1和ACS2基因得到工程菌株α5-A1和α5-A2,乙酸乙酯生成量分别比亲本菌株α5提高26.12%和23.70%;乙酰辅酶A含量分别比α5ΔACH1提高了80.33%和52.79%;结果表明,过表达ACS1和ACS2基因均能提高乙酰辅酶A含量和乙酸乙酯生成量,且乙酸乙酯生成量和胞内乙酰辅酶A的增加量呈正相关。在过表达ACS1和ACS2基因的基础上,过表达醇乙酰基转移酶ATF1基因得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1,乙酸乙酯含量分别为72.52 mg/L和44.80 mg/L,分别是单独过表达ATF1基因a5-ATF1的204.14%和125.67%,且ΔA-ATF1比α5-ATF1产乙酸乙酯显著增加,结果表明,在底物乙酰辅酶A充足的条件下,提高醇乙酰基转移酶活性,能够提高乙酸乙酯的生成量。

【参考资料】

[1]郑楠,郭庆焕,何亚辉,钱泓,赵东,陈叶福,郭学武,肖冬光.乙酰辅酶A含量对酿酒酵母乙酸乙酯合成的影响[J].中国酿造,2018,37(05):150-156.

[2]樊婧婧,赵雨佳,王晨,李春,周晓宏.酿酒酵母乙酰辅酶A精细调控合成萜类化合物研究进展[J].化工进展,2018,37(07):2773-2779.