血液DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

血液DNA提取试剂盒可用于全血样本的基因组DNA的纯化。纯化原理是首先利用红细胞裂解液先去除血液中的红细胞，细胞裂解液裂解细胞核释放基因组DNA，由硅胶膜柱可逆吸附体系内的基因组DNA，经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质等杂质后，用纯化液洗脱获得基因组DNA。

血液DNA电泳检测图

血液DNA提取试剂盒适用于未凝固全血，以及经各种抗凝剂（EDTA、肝素、柠檬酸）处理过的全血样本。一次可从0.4 ml全血中提取到3-10μg高纯度基因组DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此基因组DNA可直接用于PCR、酶切等后续实验。

操作方法

1取血液样本，每400μl血液加入到一只1.5ml离心管中。加入2倍体积的红细胞裂解液RS。漩涡振荡或上下来回颠倒混匀。5,000 rpm离心3min，弃上清，收集白色或淡红色沉淀。

对于哺乳动物全血，每400μ全血中可提取3-10μg的基因组DNA。如从鸟类、两栖类或更低级的动物血液中提取基因组DNA，因其血液中红细胞有细胞核，血液用量勿超过20μl/离心管。每20μl全血中可提取40μg的基因组DNA。

2加入200μl消化缓冲液DS，旋涡振荡直至完全分散。

3加入20μl蛋白酶K和220μl裂解液MS，漩涡振荡混匀。65℃温浴10min。溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4加入220μl无水乙醇，上下来回颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉全部淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

5加入500μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

6加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

7加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

8 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

9将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。

10 12,000 rpm离心2min，管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。

应用^[4][5]

用于鹿血的PCR-RFLP鉴定方法研究

建立鹿血PCR-RFLP（聚合酶链式反应--限制性片段长度多态性）种间及不同基原鉴定方法。寻找鹿血与非鹿血鉴别的限制性内切酶,并确定鹿血中掺入其他常见动物血的检出限度。寻找鉴别梅花鹿与马鹿血的限制性内切酶,并确定梅花鹿血中加入马鹿血的检出限度。

方法:1.用三种不同的试剂盒提取样品血液基因组DNA,测定浓度及纯度,选择适合提取本研究中动物血液基因组DNA的试剂盒。

2. 用动物DNA条形码通用引物COI和cytb（细胞色素b）,扩增样品血液基因组DNA,以扩增效率高、扩增结果稳定为指标选取引物,并优化扩增条件。

3.试剂盒法纯化PCR产物,T-A克隆（蓝白斑筛选及琼脂糖凝胶电泳确定阳性克隆）,菌液进行基因序列测定。

4.采用软件NEB Cutter2.0（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）对各样品血液的测序结果进行比对分析,确定试验中所购样品均为正品。根据各样品血液的cytb基因序列的差异,设计、选取可以区分鹿与非鹿、梅花鹿与马鹿的DNA限制性内切酶,并经实验验证。

5.将提取的各样品血液基因组DNA稀释至相似浓度,且A260在0.11.0范围内。在梅花鹿血基因组DNA中分别加入不同体积分数的非鹿类动物血基因组DNA,在梅花鹿血基因组DNA中加入不同体积分数的马鹿血基因组DNA,经PCR扩增后,产物用限制性内切酶进行切割,确定检出限度。

参考文献

[1]Molecular tracing of confiscated pangolin scales for conservation and illegal trade monitoring in Southeast Asia[J].Huarong Zhang,Mark P.Miller,Feng Yang,Hon Ki Chan,Philippe Gaubert,Gary Ades,Gunter A.Fischer.Global Ecology and Conservation.2015

[2]DNA Barcode-Based PCR-RFLP and Diagnostic PCR for Authentication of Jinqian Baihua She（Bungarus Parvus）[J].Xiaolei Li,Weiping Zeng,Jing Liao,Zhenbiao Liang,Shuhua Huang,Zhi Chao,Robert Henry.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2015

[3]Identification of Lonicera japonica and its Related Species Using the DNA Barcoding Method[J].Zhiying Sun,Ting Gao,Hui Yao,Linchun Shi,Yingjie Zhu,Shilin Chen.Planta Med.2011(03)

[4]DNA Barcoding of Panax Species[J].Yunjuan Zuo,Zhongjian Chen,Katsuhiko Kondo,Tsuneo Funamoto,Jun Wen,Shiliang Zhou.Planta Med.2011(02)

[5]凤霞.鹿血的PCR-RFLP鉴定方法研究[D].承德医学院,2018.