BRADFORD蛋白定量试剂盒的应用

背景^[1-3]

BRADFORD蛋白定量试剂盒提供了一种简单快速的方法，来测定样品中的蛋白质浓度。

Bradford实验原理：考马斯亮蓝G250,在游离状态下呈红色，光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。

BRADFORD蛋白定量效果图

Bradford蛋白质定量试剂盒特点：

1.节省时间—显色反应迅速

2.兼容性好—不受大多数化学物质的影响。对于样品中巯基乙醇和二硫苏糖醇的兼容浓度，分别可达1mM和5mM。

3.良好的检测范围—检测范围为50-1000ug/ml。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙*醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20,60,80低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

应用^[4][5]

用于人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化研究

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），通常也称之为骨形态发生蛋白或骨生成素，是一类广谱性的生长调节因子。已有的研究表明，BMPs的功能不仅仅局限于能诱导未分化的间充质细胞不可逆地转化为软骨和骨，BMPs还对组织器官的胚胎发生和形态形成起重要作用。

利用hBMP4和hBMP7的成熟肽cDNA片段制备转基因酵母菌株，从而对hBMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞共表达的实现和hBMP4／7异源二聚体的形成进行探讨。BMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞中共表达技术的建立：hBMP4与hBMP7的发酵工艺；蛋白纯化工艺；抗原反应活性及理化性质的研究。摇瓶培养确定最适培养基为BMGY／BMMY；培养基的最适pH值为6.0；甲醇诱导浓度为1％；最适诱导周期为96小时。

经斑点印迹和蛋白质印迹证实了表达产物含有hBMP4与hBMP7，均具有良好的抗原性和特异性。

经还原性和非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合蛋白质印迹鉴定，所获得的hBMP4与hBMP7为单体蛋白，分子量分别为26KD和17KD。

利用Bradford蛋白质定量法并结合Glyko BandScan量化软件的分析发现，表达上清中hBMP4表达量达到33.34mg／L，占总蛋白含量的50.4％，hBMP7的表达量达到13.76mg／L，占总蛋白含量的20.8％。用阳离子交换层析法结合疏水柱层析法进行纯化，最终纯化得到的目的蛋白纯度达到80％以上。

参考文献

[1]Whole‐exome sequencing:a powerful technique for identifying novel genes of complex disorders[J].SSSanders.Clinical Genetics.2011(2)

[2]Disorders of dysregulated signal traffic through the RAS‐MAPK pathway:phenotypic spectrum and molecular mechanisms[J].MarcoTartaglia,Bruce D.Gelb.Annals of the New York Academy of Sciences.2010(1)

[3]Perinatal Exposure to Hazardous Air Pollutants and Autism Spectrum Disorders at Age 8[J].Amy E.Kalkbrenner,Julie L.Daniels,Jiu-Chiuan Chen,Charles Poole,Michael Emch,Joseph Morrissey.Epidemiology.2010(5)

[4]Immune Therapy in Autism:Historical Experience and Future Directions with Immunomodulatory Therapy[J].Michael G.Chez,Natalie Guido-Estrada.Neurotherapeutics.2010(3)

[5]陈雅娟.人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化[D].福建师范大学,2004.