内毒素的作用和检测方法

一、内毒素是什么？

内毒素(endotoxin，ET)是构成革兰阴性细菌细胞壁外膜最外层的脂多糖 ( LPS) 成分，其基本结构高度保守，由O－特异性侧链、核心多糖和类脂 A(lipid A)组成。

二、内毒素的作用

内毒素的活性中心是类脂 A，是已知最强的免疫刺激物之一。可通过刺激单核细胞和巨噬细胞，使其产生白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、白细胞致热源(LP)等炎症介质和细胞因子。内毒素的生物活性很广泛，主要通过与靶细胞作用而诱导这些细胞产生一系列炎症介质和细胞因子表现出来的，可引起发热反应，促进前列腺素合成，促使血管活性物质的释放，降低血压，激活凝血系统和补体，引起局部过敏，影响或参与免疫反应，影响血糖及肿瘤坏死等，严重的会致死。

三、内毒素受体

目前已知的内毒素受体主要分为以下几类[1]：清道夫受体(scavenger receptor，SR)、脂多糖结合蛋白( lipopolysaccharide binding protein，LBP)、分化抗原群(cluster of differentiation antigen 14，CD14)、整合素家族(CD11/CD18)、Toll 样受体家族(TLR)、植物凝血素 S 域受体激酶(LORE)蛋白。

四、内毒素的检测

1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰阴性菌时会产生凝胶。[2]其后Levin和Bang也发现微量革兰阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。鲎长到成年需漫长的8年，杀鲎取血不仅满足不了需求而且会使鲎资源枯竭。每只雌鲎可产卵8万粒，可采血50毫升。其血液遇氧变蓝。经提纯、冷却、干燥后呈粉末状。鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。鲎试剂因能与细菌内毒素及β-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。使用鲎试剂检测的试验称为鲎试验。制备鲎试剂主要来源于东方鲎和美洲鲎，因此主要有中、美、日、德等少数国家才有生产鲎试剂。常用的检测内毒素的方法有以下：

1.凝胶法：通过鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）与内毒素发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶）的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

2.动态浊度法；浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。内毒素与鲎试剂中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原变成凝固蛋白（即产生凝胶），使液体的浊度发生变化，通过动态观察浊度变化速率检测。

3.终点显色法:通过由于细菌内毒素激活鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐），使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。

4.动态显色法:内毒素可激活鲎试剂引起一系列酶促反应，产生黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm），在一定时间内，动态观察对硝基苯胺（pNA）的生成量，与细菌内毒素浓度成正相关。但此方法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。

5.其他检测方法：还有一些直接测定内毒素定量的方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫学方法（如火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法等）等，这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化；还有一些间接测定的方法，如生物学方法利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF，通过间接测定IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量；化学发光法：应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量；流式细胞术：应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。

国内外文献报道，正常人血中内毒素浓度为：＜0.1EU/ml。随着内毒素检测技术的发展，不同的前处理方法、仪器及测定原理的不同，检测结果会存在着一定差异。由于干扰鲎试验准确性干扰因素的分析包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等，如试验的最适pH为6.25～7.25才能形成凝胶、温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，温度应控制在25～40℃之间、检测用水要求按中国药典规定稀释用的细菌内毒素检查用水应达到在（37±1）℃的条件下与0.03EU/ml鲎试剂混匀二十四小时内不产生凝集反应的标准、所用器皿要彻底的洗干净和灭菌，防止外源性内毒素的混入等等条件。因此也限制了内毒素测定应用于临床，建议当使用内毒素应用于临床诊疗过程中，临床检测内毒素时，应尽量选择定量动态水平的检测，并结合临床症状，应用合适的仪器和试剂盒来检测内毒素这一个检验指标评估和预测病人是否发生败血症，实验室应该建立标准化检测方案，以更好的为临床精准诊疗服务。

五、内毒素检测在诊断中的意义

1.可用于革兰阴性菌脓毒症的诊断：通过测定人血浆中的内毒素可对G－菌所引起的临床脓毒症的辅助诊断，作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。

2.内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS等的评价严重炎性疾病临床进程。内毒素的定量检测，可指导临床治疗、判断疗效和筛选恰当药物的一个指标。

3.外源性输注的内毒素血症的诊断：当引起不明原因发热时，通过测定输入的液体、药物或血液，看内毒素是否异常，以排除外源性输入感染可能。