细菌内毒素的检测

背景及概述^[1-2]

细菌内毒素是G-菌细胞壁的脂多糖成分，于细菌死亡解体后释放。其在有机体内作用于单核巨噬细胞产生多种细胞因子，如：肿瘤坏死因子、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干扰素、血小板激活因子等。这些因子适量时可激活免疫系统，对机体产生有益作用，过量则可引起机体严重的病理生理反应，表现为发热、低血压、心动过速、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。

细菌内毒素在有机体内与细胞因子相互作用进行复杂的信号传导，最终导致机体一系列病理反应的发生。使用一些特定的检查法，可检测内毒素的存在，并随着检测方法研究的发展，各种分析技术的交融，更多细菌内毒素检测方法应运而生。由于临床上的迫切需要，同时也随着对内毒素结构、功能与作用机制认识及检测方法研究的不断深入，在国内外，对抗内毒素药物的研究与开发日益增多。

信号通路^[1]

1. 内毒素信号的跨膜传递

内毒素信号的跨膜传递与靶细胞表面的一些蛋白分子有关。主要包括：清道夫受体(scavengerreceptor，SR)、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein，LBP)、CD14、整合素家族(CD11CD18)和Toll样受体家族(TLR)。

1）SR：主要分布于巨噬细胞表面，尤其是肝脏的枯弗细胞上，有SR-A和SR-B两种形式，其中SRA参与LPS的识别、结合和降解。SR-A的主要配体是带负电荷的多聚大分子物质、化学修饰的脂蛋白、多聚核糖核酸、阴离子的磷脂、脂多糖和磷壁酸脂等。LPS与SR结合后被内化转运至次级溶酶体，继而脱磷酸化和脱酰基化而减毒，这一过程不伴有炎症反应的发生。

2）LBP：是一种主要由肝脏合成的急性相蛋白，机体受LPS刺激后LBP可升高50～100倍。由452个氨基酸组成，其中靠近N末端94位的精氨酸和95位的赖氨酸残基对LPS结合是必需的，替换这两个氨基酸残基则使LPS的结合能力减弱甚至消失，C末端与转移LPS至CD14的功能有关。LBP不仅可将LPS传递给CD14，也可将其传递给磷脂尤其是高密度脂蛋白，结合了HDL的LPS不会激活效应细胞。

3）CD14：是最早确认的LPS受体。机体内有两种形式的CD14，一种是膜结合形式(mCD14)，主要分布于髓样细胞表面，并作为这类细胞的分化标志，mCD14通过糖基磷脂酚肌醇(GPI)锚定在细胞膜上；另一种是可溶性形式(sCD14)，主要存在于血清等体液中，介导非髓样细胞的LPS激活，主要来自髓样细胞表面mCD14的脱落及髓样细胞、肝细胞的合成分泌，可能与肝脏清除内毒素有关。LBP、LPS和CD14的三元复合物，一方面可通过膜上的其他蛋白向胞内传递信号，另一方面也可以内化到胞内，LPS被AOAH酶水解而降低毒性。

4）CD11CD18：CD11CD18是广泛存在于白细胞表面的一类跨膜糖蛋白，CD11的三种异构体CD11a、CD11b、CD11c分别与CD18结合形成三种同源异质二聚体分子：CD11aCD18也称白细胞功能相关分子-1(LAF-1)、CD11bCD18(CR3)和CD11cCD18(CR4)。CR3能识别补体成分iC3b、ICAM-1、纤维蛋白质、大肠埃希菌和利什曼原虫等多种内外源性物质。这三种整合素异构体均能与未经调理的细菌和LPS结合至单核巨噬细胞、多形核细胞上。虽然CD18缺陷并不影响细胞对LPS的应答反应，但临床研究表明CD18缺陷常会导致反复发作的细菌感染、局部脓疡和伤口愈合困难。同时多项研究表明LPS诱导靶细胞合成和分泌细胞因子有赖于CD11cCD18。

5）TLR：目前发现的TLR成员有十多种，主要分布于一些免疫器官如脾脏和胸腺等，参与LPS信号跨膜传递的TLR主要有TLR2、TLR4和TLR5。

2. LPS信号的细胞内传递

LPS的胞内信号传递至少要涉及几种通路，但最终都要激活NF-kB或丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)。革兰阴性细菌在侵入人体后，LPS脱落与血清中的LBP结合，LBP将其传给mCD14，形成LPS-LBP-CD14三者复合物，而后LPS以三者复合物形式活化TLR4信号传导，辅助分子MD-2能增强这一过程。由于TLRs胞内区域与IL-1R的胞内区域同源性较高，并有特征性的TIR区域，所以它们的信号传递链基本相同，但对不同的信号的刺激还是有所区别。

检测方法^[1，3]

1. 鲎试验法(LT)

1968年，由Levin和Bang发现并建立了鲎试验法检查细菌内毒素，因其简便、快速、灵敏、重现性好等优点，成为药品检验中热原检查家兔法的替代方法。LT的基本原理为：鲎血变形细胞中含凝固蛋白原、凝固酶原、B因子和C因子。在微量LPS参与下，C因子首先被激活，然后活化的C因子激活B因子，活化的B因子活化凝固酶原，最后促使凝固蛋白原转为凝固蛋白。目前有凝胶法(Cel-clottechique)、比浊法(turbidmetricassay)、比色法(colorimetricassay)和免疫学方法等。

1）半定量测定-凝胶法：凝胶法是各国药典细菌内毒素检查的首选方法。它是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，终点判断采用翻转180°的目测法。药典2000年版附录ⅪE详细说明了此法操作过程及结果判断。

①检查法：取装有0.1mL鲎试剂溶液的10×75mm试管(或0.1mL/支规格的鲎试剂原安瓶)4支，其中2支加入0.1mL供试品作为供试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品溶液0.1mL作为阳性对照管，1支加入细菌内毒素检查用水0.1mL作为阴性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2min。保温过程和拿取试管应避免受到振动造成假阴性结果。②结果判断：将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。

供试品两管均为(-)，应认为符合规定；如两管均为(+)，应认为不符合规定；如2管中1管为(+)，1管为(-)，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为(+)，即认为不符合规定。阳性对照为(-)或阴性对照为(+)，试验无效。此法操作较简单，经济，不需要专用测定设备，可在0.03EUmL的范围内进行半定量测定。其缺陷为特异性不强，精密度、定量性较差。

2）定量测定：随着鲎试验方法的测定仪器的不断完善，内毒素测定已向微量定量方向发展。定量测定在常规药品检查、生产过程质控、各种除热原方法的评价、特殊样品的检查(如血液、尿液、脑脊液)等方面，与凝胶法相比具有灵敏、快捷、准确的特点。据统计，当今美国鲎试剂的应用当中，超过50%的检查采用了定量方法。

①浊度法(比浊法)：浊度法是一种对浊度增加的光检测，根据测定原理的不同可分为终点-比浊法和动态-比浊法。终点-比浊法是基于细菌内毒素浓度和反应混合物的终点浊度(吸收度或透光率)之间的定量关系的一种检测方法；动态-比浊法是测定反应溶液达到规定浊度所需时间(比浊时间)或测定溶液自身的浊度变化率的一种方法。通常在0.006～300EUmL范围内进行定量测定。此法操作简单、快速、灵敏度高、检测范围宽，但需要精密的专用仪器。

②显色基质法(显色法)：显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。

动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。在内毒素的作用下，前凝固酶转变为凝固酶时，能使一种含对硝基苯胺(PNA)的三肽(BocLeu-Gly-Arg-PNA)水解，释放出黄色的PNA，在一定培养条件下，内毒素量和PNA释放量呈线性关系，测定波长为405nm。

2. 免疫学方法

有关免疫学方法的研究报道有酶联免疫吸附检测法(LAL-ELISA)、火箭免疫电泳鲎试验法(TALRIE)、L-聚赖氨酸ELISA法、双抗体夹心ELISA法等。这些方法的特点是特异性、准确度高，但其应用尚待临床实践的验证，操作尚待进一步简化。

3. 生物学方法

利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF-α的特性，以标化的细胞系作为靶细胞，检测细胞培养上清中的IL-1、TNF-α等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量。

4. 化学发光法

应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量。

5. 流式细胞术

应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定后，应用流式细胞仪进行检测。

6. 高效液相色谱

将内毒素中类脂A部分衍化后，以HPLC法检测。

主要参考资料

[1] 细菌内毒素研究进展

[2] 细菌内毒素检查新方法进展

[3] CN201310116759.1一种细菌内毒素检测方法