CIDEC抗体的应用

背景^[1-3]

CIDEC抗体是一种可以特异性结合CIDEC的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的CIDEC蛋白。CIDEC抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

CIDEC，即诱导细胞死亡的DFF45样效应因子C，别名FSP27。它是一种在小鼠脂肪细胞中首次分离得到的蛋白质，随后在人类肝细胞、脂肪细胞等多种细胞中被发现，属于CIDE家族。CIDEC在脂滴表面定位，通过在脂滴间形成特殊的孔/通道样结构，促进脂质从小脂滴转移到大脂滴，从而调节脂肪代谢和机体能量平衡。CIDEC不仅在促进脂肪储存和脂滴体积增大中发挥作用，还在细胞凋亡方面发挥重要作用。CIDEC的异常表达与多种代谢性疾病相关，如肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝病等。

CIDEC抗体

CIDEC抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（CIDEC抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CIDEC抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

CIDEC抗体可以用于CIDEC在人脂肪细胞分化中的作用及其机制研究

研究CIDEC在人类脂肪细胞分化中的作用,期望为今后治疗肥胖提供新的靶点。目的1、研究CIDEC的表达与脂肪细胞分化的关系;2、研究CIDEC的亚细胞定位;3、研究下调CIDEC表达对脂肪细胞分化的影响及机制。

方法：1、利用CIDEC抗体免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot方法检测CIDEC在不同发育阶段的人胚胎脂肪组织以及不同分化程度脂肪肿瘤组织中的表达变化;2、构建CIDEC与荧光蛋白融合表达的质粒,利用脂质体转染COS-7细胞,以确定CIDEC蛋白的亚细胞定位。3、体外原代培养人前脂肪细胞,并进行诱导分化,检测不同分化阶段CIDEC的表达水平。4、利用慢病毒siRNA沉默CIDEC的表达,以研究下调CIDEC表达对脂肪细胞分化的影响,并分析其机制。

结果：1、CIDEC的表达水平与脂肪细胞的分化相关采用CIDEC抗体免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot方法比较了3例不同发育阶段的胎儿脂肪组织中CIDEC的表达情况,同时检测调控脂肪细胞分化关键分子PPARγ的变化。结果显示,无论mRNA还是蛋白水平,CIDEC均呈现随着分化成熟逐渐增高的趋势,并且与PPARγ的表达趋势完全一致。对30例人体正常脂肪组织和45例不同分化程度的脂肪肿瘤组织的免疫组织化学染色结果显示,CIDEC随着脂肪细胞分化程度降低而表达降低。采用Real-time PCR和Western blot方法的研究结果显示,同正常脂肪组织相比,脂肪瘤中CIDEC的表达变化不显著,而分化好的脂肪肉瘤、黏液型脂肪肉瘤及去分化脂肪肉瘤中CIDEC的表达均显著降低(n=5,*p<0.05)。此外,通过体外实验原代培养人前脂肪细胞,并诱导成为成熟脂肪细胞,随着脂肪细胞的诱导分化成熟,CIDEC和PPARγ的表达水平同诱导前相比急剧升高(*p<0.05),同脂肪分化标志分子FABP4变化趋势一致。以上体内、外实验结果提示,CIDEC在脂肪细胞分化过程中发挥重要作用。

参考文献

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