DAB1抗体在乳腺癌DAB1表达研究中的参数对照与染色定位

乳腺癌的复发、局部浸润与远处转移始终是治疗失败的主要原因，寻找能够稳定反映恶性程度与预后的分子标志物因而成为乳腺癌研究的基础任务。DAB1（Disabled-1）编码含555个氨基酸的胞内衔接蛋白，N端含磷酸酪氨酸结合／蛋白相互作用结构域，可与多个含NPxY基序的跨膜蛋白结合，基因定位于染色体1p32.2的普通型脆性位点^[1,3]。DAB1抗体是针对DAB1蛋白（Disabled homolog 1）的免疫球蛋白，主要用于神经发育、信号转导等领域的研究。

研究团队把DAB1的表达放进四株人乳腺细胞中做梯度比较。以正常乳腺上皮细胞MCF-10A中DAB1 mRNA相对表达水平0.998为基准，恶性程度较低的MCF-7降至0.504，高恶性程度的BT-549与MDA-MB-231分别降至0.302与0.330。蛋白层面由DAB1抗体的免疫印迹给出同向结果，以Actin为内参的积分光密度比值由MCF-10A的0.227依次降至0.134、0.076与0.074^[1]。该研究选用的DAB1抗体按1:1000稀释、内参抗体按1:3000稀释，5%牛血清白蛋白封闭后于4 ℃孵育过夜，每孔上样60 μg总蛋白，目标条带位于约80 kD处。进一步的外源过表达实验显示，BT-549细胞转染后G1期细胞比例由未处理对照组的29.29%升至56.58%，出现G1期阻滞^[1]。对需要复现的研究者而言，这一段给出的上样量、稀释比与分子量位置都可以直接作为参考。

另有研究收集乳腺癌组织与癌旁组织各80例，在同一评分体系下并行检测DAB1与E-钙粘蛋白。所用DAB1抗体为兔抗人来源，工作浓度1:600，E-钙粘蛋白抗体按1:200使用。切片经EDTA抗原修复液在pH 8.0条件下高温高压修复40 min，3%过氧化氢灭活内源性生物素后以山羊血清封闭^[2]。结果显示，DAB1在癌组织中的阳性表达率为45.00%，在癌旁组织中为75.00%。E-钙粘蛋白的阳性率由癌旁的85.00%降至癌组织的60.00%。两者与年龄、月经史及肿瘤大小无关，而与TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关。Spearman相关分析提示DAB1与E-钙粘蛋白呈正相关^[2]。DAB1抗体与上皮标志物抗体在同一批切片上并行染色，使衔接蛋白下调与上皮表型丢失同步出现这一观察有了组织学层面的直接证据。

研究以50例乳腺癌组织及距癌灶3 cm的癌旁组织为对象，用SP法免疫组化检测DAB1。该研究的DAB1抗体同样为兔抗人来源，说明书标注的工作浓度范围为1:100至1:2000，实验实际选用1:200。切片以柠檬酸缓冲液在pH 6.0条件下高压抗原修复，山羊血清室温封闭15 min，一抗于湿盒中4 ℃孵育过夜，生物素标记二抗与辣根酶标记链霉卵白素均于37 ℃孵育15 min，DAB显色后经苏木精复染^[3]。结果同样是癌组织低于癌旁，阳性表达率为48.0%对84.0%。分层数据更值得细看：高分化、中分化与低分化组织的阳性率依次为66.7%、59.1%与7.7%，TNM I、II期高于III、IV期，无淋巴结转移者高于有转移者^[3]。数据库分析还显示乳腺癌中DAB1 mRNA明显下调，而高表达者的总生存期更长。

综合以上三项研究，发现可组成一套可复用的参照系：DAB1抗体在免疫印迹中按1:1000、在免疫组化中按1:200至1:600使用，一抗于4 ℃孵育过夜是三项研究的共同条件，封闭剂在牛血清白蛋白与山羊血清之间取舍，修复在EDTA pH 8.0与柠檬酸pH 6.0两套高压方案之间选择，目标条带位于约80 kD、内参选用Actin^[1-3]。据此选型需注意：确认免疫原对应的表位是否落在DAB1各结构域保守区之外以减少交叉，确认抗体能否区分磷酸化与非磷酸化形式，在敲低或敲除模型中验证目标条带消失，并考察批间一致性，尤其在样本需跨越免疫组化与免疫印迹两种场景时。乳腺癌中DAB1低表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移及生存期的关联，最终都要落在蛋白这一层。

参考文献

[1] 曹让娟, 李凯, 邢琬莹, 等. Disabled-1在人乳腺癌细胞中的表达及其对细胞周期的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(5): 932-936.

[2] 曹自平, 江豁达, 姜良勇, 等. 乳腺癌Dab1、E-cad的表达及其在上皮间质转化中的作用[J]. 医学信息, 2020, 33(4): 80-82.

[3] 王同玫, 张一奇, 文普帅, 等. 乳腺癌组织中Dab1蛋白表达及其临床相关性研究[J]. 中国现代医学杂志, 2018, 28(15): 32-36.