人骨成型蛋白2(BMP-2)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人骨成型蛋白2(BMP-2)ELISA KIT采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。

骨形态发生蛋白（BMP），除BMP-1外其余均属于转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族。BMP是低分子量（约30，000Da）、不含胶原的糖蛋白,成熟BMP分子是由一个依赖半胱氨酸二硫键固定的双链（每链含有400个氨基酸）多肽二聚体分子,而且重要的结构40%～50%与TGF-β高度同源。BMP是以一个大的前体蛋白的形式合成的,包括信号肽部分、前结构域和羧基末端区，蛋白水解酶将羧基末端从前体蛋白切割下来后即形成二聚体。

人骨成型蛋白2(BMP-2)Elisa试剂盒操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于不同浓度表儿茶素没食子酸酯对体外培养成骨细胞的影响研究

究不同浓度表儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）对体外培养成骨细胞的影响,确定作用浓度（抑制浓度或促进浓度）。

方法:取新生SD大鼠的颅骨进行成骨细胞诱导培养,第3代细胞中分别加入浓度为0,1,10,20,30和40μmol/L的EGCG+含10%胎牛血清DMEM培养基培养。

应用CCK-8法、茜素红染色和硝酸银染色法、ALP试剂盒、ELISA法、Western blot法、观察并测定EGCG对体外培养成骨细胞的增殖、矿化结节形成、碱性磷酸酶活性、骨成型蛋白2（BMP-2）、血管内皮生长因子（VEGF）及对Runx2、BMP-2蛋白表达量的影响。

结果:与0μmol/L浓度组比较,EGCG 1020μmol/L浓度组具有明显促进增殖的作用;30μmol/L及以上浓度组表现出对大鼠成骨细胞的抑制作用;在不同浓度EGCG中培养7天或14天,可以清晰的观察到矿化组织形成,1020μmol/L EGCG培养的细胞矿化结节形成数量显著多于对照组;1020μmol/L浓度组碱性磷酸酶活性明显高于其他各组;骨成型蛋白2（BMP-2）、血管内皮生长因子（VEGF）检测显示EGCG1020μmol/L浓度组促进成骨细胞分泌BMP-2、VEGF的作用最强,30μmol/L及以上浓度对它们的分泌具有抑制作用;经测定,BMP-2、Runx2蛋白的分泌量在EGCG1020μmol/L浓度组达到最高。

参考文献

[1]Low-intensity pulsed ultrasound enhances bone formation around miniscrew implants[J].Khaliunaa Ganzorig,Shingo Kuroda,Yuichi Maeda,Karima Mansjur,Minami Sato,Kumiko Nagata,Eiji Tanaka.Archives of Oral Biology.2015(6)

[2]Efficacy and safety of currently marketed anti-osteoporosis medications[J].J.Y.Reginster,A.Neuprez,N.Dardenne,C.Beaudart,P.Emonts,O.Bruyere.Best Practice&Research Clinical Endocrinology&Metabolism.2014(6)

[3]Future directions for new medical entities in osteoporosis[J].Serge Ferrari.Best Practice&Research Clinical Endocrinology&Metabolism.2014(6)

[4]Serum ferritin levels are positively associated with bone mineral density in elderly Korean men:the 2008–2010 Korea National Health and Nutrition Examination Surveys[J].Kyung Shik Lee,Ji Su Jang,Dong Ryul Lee,Yang Hyun Kim,Ga Eun Nam,Byoung-duck Han,Kyung Han,Kyung Hwan Cho,Seon Mee Kim,Youn Seon Choi,Do Hoon Kim.Journal of Bone and Mineral Metabolism.2014(6)

[5]谢睿锋.不同浓度表儿茶素没食子酸酯对体外培养成骨细胞的影响[D].山西医科大学,2018.