肝细胞培养基的应用

背景^[1-3]

肝细胞培养基是专门为正常人类肝细胞体外培养设计的最适于其生长的培养基。是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

肝细胞培养基包含500 ml基础培养基，25ml胎牛血清,5ml肝细胞生长添加物和5 ml青霉素/链霉素溶液。

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含许许多多复杂的细微结构：如细胞核、细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、微粒体及饮液泡等组成。

应用^[4][5]

用于TGF—β1对肝细胞再生分化及凋亡的调控作用机制研究

转化生长因子β1被认为是典型的多功能细胞因子，参与调节重要的细胞功能诸如增殖、分化以及组织增生、免疫等基本的生理作用。近来发现TGF-β1还有一个重要的功能，它可以抑制多种人类肿瘤的生长。对TGF-β1敏感性的丧失据认为是肝硬化及肝癌的重要致病因素。阐释肝细胞生长与凋亡调控的分子和细胞学机制，也许能为肝脏疾病的防治提供新的思路。

方法通过50％CCL4腹腔注射，用8W时间诱发BALB／c小鼠形成肝硬化模型。应用改良的胶原酶原位灌注法分离正常和肝硬化小鼠的肝细胞。利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带来观测TGF-β1诱导的凋亡。为检测TGF-β1（5ng／ml）及caspase诱导的凋亡，应用DNA荧光染料Hoechst 33342对肝细胞核进行了染色，并在荧光显微镜下观察比较caspase-3和caspase-8在TGF-β1诱导的凋亡中的作用。

选用了三种含有不同p53基因状态的人肝癌细胞系，应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）对TGF-β1诱导的肝癌细胞的凋亡进行了定量检测。为明确凋亡机制，对上述细胞系还进行了荧光素酶定量检测。首先应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶，t3基因的TGF小l可诱导的荧光素酶报矢质粒对细胞进行了转染，后经TGF小作用，分别检测其相对荧光素酶活性。

在应用TU’NEL检测的三个细胞系中，TGF－pl仅能诱导HepGZ细胞（野生型p53）凋亡，而Hub7（突变型p53）和Hep3B细胞（缺失型p53）则凋亡较少。荧光素酶检测提示HepGZ细胞对TGF下反应较强，而Hub7和Hop3B细胞其荧光素酶的表达较低。这提示凋亡与Smad以及p53的表达具有明确的联系。

参考文献

[1]The role of p53 in tumour suppression:lessons from mouse models[J].L.D.Attardi,T.Jacks.Cellular and Molecular Life Sciences.1999(1)

[2]Reciprocal expression of bcl-2 and p53 oncoproteins in urothelial dysplasia and carcinoma of the urinary bladder[J].Benyi Li,Hiroshi Kanamaru,Sakon Noriki,Tadanori Yamaguchi,Masaru Fukuda,Kenichiro Okada.Urological Research.1998(4)

[3]Hepatic fibrosis as wound repair:A progress report[J].D.Montgomery Bissell.Journal of Gastroenterology.1998(2)

[4]Bcl-2 blocks apoptotic signal of transforming growth factor-βin human hepatoma cells[J].Yu-Lun Huang,Chen-Kung Chou.Journal of Biomedical Science.1998(3)

[5]王春雷.TGF—β1对肝细胞再生分化及凋亡的调控作用机制[D].中国人民解放军军医进修学院,2003.