HT培养基的应用

背景^[1-3]

HT培养基用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞的培养基。是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下,这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培养基。

HT培养基加入添加剂HT（HTSupplement），HT是次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂，溶解后用培养液稀释，作为DNA补救合成途径的补充剂用于杂交瘤筛选培养基的添加剂和营养添加剂以克服细胞内残留氨基喋呤（Aminopterin）对DNA经典合成途径的抑制作用。

次黄嘌呤又名6-羟基嘌呤。白色针状结晶。150℃分解。溶于稀酸及碱液，微溶于沸水，不溶于冷水。存在于转移核糖核酸中。可以氰乙酸乙酯为原料制得4，5-二氨基-6-羟基嘧啶，再与甲酸环合而得。用作生物培养剂，也用于生化研究。HT培养基添加剂(HTSupplement)为粉剂，经照射灭菌。

杂交瘤细胞（hybridoma）是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备。

杂交瘤技术是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象。他可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。

应用^[4][5]

用于分泌抗鼠疫杆菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立研究

应用杂交瘤技术，制备分泌抗鼠疫杆菌F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，让其持续性产生F1单克隆抗体，为建立鼠疫的快速诊断方法提供抗体源。

方法：用鼠疫杆菌的特异成分F1抗原免疫6～8周龄、健康的雌性BALB／c小鼠，然后检测小鼠血清中的F1抗体效价，选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合，融合前三天用100μg F1抗原腹腔注射加强免疫一次，然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2／0骨髓瘤细胞混合后，50％的PEG作为细胞融合剂，融合后的细胞用HAT培养液接种于96孔细胞培养板中进行选择培养，用间接ELISA法检测细胞培养上清液中的F1抗体，筛选出的F1抗体阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆，经过四次克隆化后获得了能稳定分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

结果：经过13次的细胞融合试验后，获得了三株能稳定分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为IV1B12、IV2C10和IV2C6，用间接ELISA法检测其培养上清液中的F1单克隆抗体，F1抗体滴度分别为IV1B12 1：1280～1：10240、IV2C10 1：2560～1：10240和IV2C6 1：5120～1：10240。结论：应用杂交瘤技术，成功制备了三株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为进一步建立鼠疫快速诊断技术奠定了坚实的基础，同时也基本建立了杂交瘤技术的实验程序。

参考文献

[1]Mesenchymal traits are selected along with stem features in breast cancer cells grown as mammospheres[J].Silvia Borgna,Michela Armellin,Alessandra di Gennaro,Roberta Maestro,Manuela Santarosa.Cell Cycle.2012(22)

[2]Rock-dependent calponin 3 Phosphorylation regulates myoblast fusion[J].Yukinao Shibukawa,Natsuko Yamazaki,Etsuko Daimon,Yoshinao Wada.Experimental Cell Research.2012

[3]Natural Innate and Adaptive Immunity to Cancer[J].Matthew D.Vesely,Michael H.Kershaw,Robert D.Schreiber,Mark J.Smyth.Annual Review of Immunology.2011

[4]Functional Analysis of the Transmembrane Domain in Paramyxovirus F Protein-Mediated Membrane Fusion[J].Mei Lin Z.Bissonnette,Jason E.Donald,William F.DeGrado,Theodore S.Jardetzky,Robert A.Lamb.Journal of Molecular Biology.2008(1)

[5]尹家祥.分泌抗鼠疫杆菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立[D].昆明医学院,2004.