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赖氨酸脱羧酶培养基的应用

发布日期:2020/9/11 11:55:28

背景[1-3]

赖氨酸脱羧酶培养基可以用于细菌赖氨酸脱羧酶试验。

配置方法

将蛋白胨、肉膏、葡萄糖、琼脂及吡哆醛溶化后,调整pH为6.0~6.3。再按量加入溴甲酚紫和甲酚红。在每100ml基础培养基内,分别按1%加入L-赖氨酸。另100ml基础培养基不加氨基酸作为对照。加入氨基酸后再调整pH至6.0~6.3,分装小试管,15磅15分钟灭菌,置高层。使用前,表面覆盖一层灭菌液体石蜡。

赖氨酸脱羧酶培养基用于细菌生化试验。其中蛋白胨、酵母粉提供氮源,葡萄糖提供碳源,溴甲酚紫作为酸碱指示剂,L-赖氨酸作为反应底物。具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺)和二氧化碳,使溶液为碱性,溴甲酚紫保持紫色。如果不脱羧,肠杆菌科的细菌能分解葡萄糖,产酸,溴甲酚紫变为黄色。

氨基酸脱羧的对照管为葡萄糖发酵管,不含氨基酸,由于实验结果阳性的为保持紫色不变,阴性结果为黄色,为保证结果的可靠性,须同时接种对照管,如对照管变为黄色,说明细菌接种成功,证实试验管紫色(不变色)为阳性,而非未接种好细菌。此外,由于氨基酸脱羧的产物为尸胺、腐胺等,遇氧不稳定,故各管接种完细菌后,需加入几滴液体石蜡隔绝空气,保持胺的稳定性。

应用[4][5]

用于微生物转化L-赖氨酸为尸胺的研究

以赖氨酸这种微生物代谢产物为原料,利用蜂房哈夫尼菌(Hafnia.alvei AS 1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,EC 4.1.1.18)将其转化成尸胺。

建立了赖氨酸脱羧酶酶活测定方法,优化了赖氨酸脱羧酶产酶培养基和产酶条件,建立了转化体系。赖氨酸脱羧酶酶活测定采用瓦勃氏呼吸仪测定脱羧产生的CO2的方法,确定酶活测定条件为温度35℃,pH 5.0,离子强度0.2mol/L,底物浓度1g/100mL。用响应面法对蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基和培养条件进行优化。

得到产酶培养基为葡萄糖1.84%,酵母膏2.20%,玉米浆3.66%,MgSO40.03%K2HPO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%,酶活达到203.14U/mL。摇瓶培养条件为起始pH6.5、接种种龄11h、接种量5%、装液量25mL(250mL三角瓶)摇瓶转速170r/min,摇床震荡培养11 h后进行诱导,诱导阶段pH 5.5,静置培养7 h酶活最高,诱导物L-赖氨酸加入量为0.5%,采用在培养基中直接添加的方式,酶活达到278.56 U/mL。摇瓶发酵过程曲线表明,17h的细胞酶活最高,选择培养17h的细胞进行后续转化试验。

对转化体系进行研究,结果表明直接转化的投料量为1%时转化率35.06%,投料量为2%时26.90%,但此方法有很大局限性,不利于高浓度底物转化;缓冲体系在带塞的三角瓶中100r/min震荡转化,转化温度为37℃,转化体系的pH为5.0,细胞浓度为25mL菌液冲悬在75mL缓冲液中,吐温-80加入量为0.01%,缓冲液浓度为0.6mol/L时,投料量为4%时转化率为81.34%。

参考文献

[1]Influence of iron depletion on growth and production of catechol siderophores by different Frankia strains[J].M.Arahou,H.G.Diem,A.Sasson.World Journal of Microbiology and Biotechnology.1997(1)

[2]d-Lysine production from l-lysine by successive chemical racemization and microbial asymmetric degradation[J].E.Takahashi,M.Furui,H.Seko,T.Shibatani.Applied Microbiology and Biotechnology.1997(4)

[3]Ornithine decarboxylase antizyme:a novel type of regulatory protein[J].Shin-ichi Hayashi,Yasuko Murakami,Senya Matsufuji.Trends in Biochemical Sciences.1996(1)

[4]Cloning and characterization of a lysine decarboxylase gene from Hafnia alvei[J].Lothar F.Fecker,Horst Beier,Jochen Berlin.MGG Molecular&General Genetics.1986(1)

[5]朱婧.微生物转化L-赖氨酸为尸胺的研究[D].天津科技大学,2009.

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