人生长激素释放因子(GH-RF)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人生长激素释放因子(GH-RF)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人生长激素释放因子(GH-RF)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的人生长激素释放因子(GH-RF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人生长激素释放因子(GH-RF)是由丘脑下部、脑下垂体神经分泌系统产生，是从正中隆起所分泌的多肽，它直接刺激腺性脑下垂体的生长激素（GH）分泌细胞抑制GH的分泌。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于生长激素释放因子和垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的共表达研究

生长激素释放因子(GRF)和垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)都是由下丘脑合成并分泌,是存在人和动物体内的生物活性物质,促进垂体生长激素(GH)的合成与分泌是其共有的生理功能。二者对提高动物的生长速度和畜牧业的发展具有重要意义。

研究人工合成了PACAP和GRF基因,构建了pIRES1-GRF-PACAP、pIRES1-PACAP、pIRES1neo-GRF真核表达载体;三种真核表达载体在CHO细胞瞬时表达,经RT-PCR、Dot-ELISA、Western blot检测结果阳性,同时证明表达产物具有促进IGF-1的分泌作用;以PLGA为载体,采用复乳-液中蒸发法制备了重组质粒微球,分别给小鼠和獭兔肌注质粒微球结果表明,实验组动物累积增重与生理盐水组比差异显著,GRF和PACAP双基因质粒微球组促生长效果优于单基因质粒微球组,双基因质粒微球组动物血清中IGF-1的浓度高于生理盐水组和单基因组。

以上实验结果表明,微球介导的双基因在提高动物体内IGF-1浓度和生长速度方面明显优于生理盐水组,同时也高于单基因组,首次证明二者在体内具有协同促生长作用,为利用基因转染技术提高动物生产性能开辟了一条新途径。

参考文献

[1]Rodriguez-Arnao.Isolation and characterization of the bovine hypothalamic growth hormone releasing factor Clin.Comez-pan A.Endocrinol Metab.1983

[2]Efficient Gene Transfer Into Human Hepatocytes by Baculovirus Vectors Hum.Clark K.R.Gene Therapy.1997

[3]Cell-Surface Expression and Purification of Human CD4 Produced in Baculovirus-Infected Insect Cells Crit.Tong D.Rev Nature.1992

[4]Cyclic Amphipathic Peptide-DNA Complexes Mediate High-Efficiency Transfection of Adherent Mammalian Cells Bioconjug.Haensler.J,Szoka F.C.Chemtracts.1993

[5]刘松财.生长激素释放因子和垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的共表达[D].吉林大学,2005.