棘白菌素B制备

【背景及概述】^[1][2][3]

上世纪70年代以来，真菌感染无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加，特别是在免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者、肿瘤患者以及那些患有其它疾病而正进行免疫治疗的患者中。直到20世纪80 年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功，临床方能有效而安全地控制真菌感染。虽然这些药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物选择性差、耐药真菌的出现以及对诸如曲 霉和白色念珠菌等真菌的敏感性不强等原因，深部真菌感染疾病的死亡率仍居高不下。因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。众所周知，真菌细胞具有细胞壁而哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，真菌细胞壁是新型抗真菌药物的理想靶点。

棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物，由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β‑(1，3)‑D‑葡聚糖的合成，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。其作用机制独特，不良发应率低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具 有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白色念珠菌等感染趋势上升的真菌 具有良好的杀灭作用。棘白菌素类抗生素主要有三种类型：B，C和D。其中棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)是最主要的类型。棘白菌素B是于1974 年Nyfeler R.等人发现的由曲霉菌属Aspergilus nidulans和Aspergilus rugulosus发酵产生的，但由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。 以棘白菌素B为先导化合物进行结构改造，可以得到一些具有临床应用价值的化合物，如西洛芬净、卡帕芬净、米卡芬净、阿尼芬净。西洛芬净由于毒性和剂型问题终止了研究开发，但后三者已先后在美国 (2001年)、日本(2002年)、美国(2006年)首次上市。

【用途】^[4]

棘白菌素B可用于制备棘白菌素类药物，如阿尼芬净，阿尼芬净是由棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)通过微生物转化切除脂肪酸侧链，得到棘白菌素B母核(Echinocandin B Nucleus, ECBN)后，再通过化学合成的方法加上新的侧链而制得。

【制备】^[2][3]

方法1：一种高纯度EchinocandinB的制备方法，包括下述步骤：

1) 棘白菌素B发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

2) 在固形发酵培养物中加入极性溶剂浸泡；

3) 浸泡液固液分离，得到棘白菌素B提取液；

4) 将调低极性溶剂浓度的提取液导入大孔吸附树脂进行富集；

5) 吸附完毕，用梯度极性溶剂洗涤树脂，然后用解吸剂进行解吸；

6) 解吸液脱色，搅拌均匀后过滤；

7) 脱色液浓缩、萃取、结晶得棘白菌素B粗提物；

8) 粗提物经Fraclite800层析分离，得到高纯度的棘白菌素B产品。

方法2：一种棘白菌素B的提取纯化方法，包括如下步骤：

步骤一、酸化棘白菌素B的发酵液，过滤获得菌丝体滤液；

步骤二、将步骤一得到的菌丝体滤液通过以浓缩分离超滤膜为组件的超滤设备，调节为25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为3.0～5.0L/h进行浓缩，得到分离后的透过液；

步骤三、将步骤二得到的透过液通过以钠滤膜为组件的超滤设备，调节温度为 25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为1.0～3.0L/h进行浓缩，得到浓缩液；

步骤四、用凝胶柱将步骤三得到的浓缩液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，得到棘白菌素B的粗品；

步骤五、将步骤四得到的棘白菌素B的粗品重结晶、加热回流和冷却干燥后，得到棘白菌素B的纯品。

采用对发酵液提取、超滤大分子、钠滤小分子、凝胶柱分离、重结晶、加热回流和冷却干燥，得到棘白菌素B的纯品，操作简单方便，降低了生产成本。同时，操作提取过程在较低温度下进行，对棘白菌素B无破坏作用，不会产生多余杂质，提高了产品的收率及产品的质量。

【主要参考资料】

[1] 李继安;陈详;阮建昌;林慧敏;陈代杰;沈剑锋;阮霞琴;石飞燕;董华成.微生物酶转化棘白菌素B的方法 . CN201110330116.8，申请日2011-10-26

[2] 林毅;张雪霞;李晓露;李宁;任风芝;王海燕;张金娟;张丽;林旸;陈书红;张艳立;成晓迅;高月麒;王宁;蒋沁;段宝玲.一种高纯度棘白菌素B的制备方法. CN201110244359.X ，申请日2011-08-24

[3] 王克柳;王美海.棘白菌素B的提取纯化方法 . CN201610023776.4 ，申请日2016-01-14

[4] 史洲洋. 棘白菌素 B 及其母核的分离纯化工艺研究[D]. 上海师范大学, 2014.