棘白菌素B的制备方法

背景及概述^[1][2]

棘白菌素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。其中阿尼芬净(Anidulafungin)是继卡泊芬净(Caspofungin)、 米卡芬净(Micafungin)之后的第三代全身抗真菌类棘白菌素衍生物药物， 2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证， 主要治疗念珠菌血症和其他形式的念珠菌感染(腹腔脓肿、腹膜炎)和食管念珠菌等。阿尼芬净是由前体化合物棘白菌素B经犹他游动放线菌产生的酰化酶作用脱去侧链亚油酰基，然后在DMF中与活性中间体 4"-戊氧基-[1,1',4',1"]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反应制得。

20世纪70年代，人类首次发现了具有抑制真菌细胞壁合成物质——棘白菌素类化合物，酰胺、丝氨酸、苏氨酸和鸟氨酸，不同的氨基酸以及脂肪酸侧链导致了棘白菌素类药物的化学多样性。棘白菌素B的开发具有较好的市场前景。棘白菌素类药物具有作用机制独特，不良反应率低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性等特点。

制备方法^[1-2]

方法一、对棘白菌素B的分离有比较大的难度，先前用各种方法分离到的棘白菌素B的纯度都不高，US6506726将发酵液酸化以后使用HP20、SP825、SP207等大孔树脂分离纯化棘白菌素B，但是该方法分离到的产物的纯度低，产品含量最多只能到80％左右，不符合目前市场上对该产品的要求。US4288549中采用了硅胶层析、萃取等方法得到棘白菌素B的方法，但是该方法采用了压力柱，而且对色素的分离也比较难，同样导致纯度不高。国内公开号为CN103724403A的专利，提供了另外一种从发酵液中分离棘白菌素B的方法，该方 法通过发酵提取，同样也是从反向硅胶中分离纯化，但该方法步骤非常长，操作繁琐，导致对棘白菌素B的提取率比较低。

CN201610023776.4提供了一种棘白菌素B的提取纯化方法，包括如下步骤：

步骤一、酸化棘白菌素B的发酵液，过滤获得菌丝体滤液；

步骤二、将步骤一得到的菌丝体滤液通过以浓缩分离超滤膜为组件的超滤设备，调节温度为25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为3.0～5.0L/h进行浓缩，得到分离后的透过液；

步骤三、将步骤二得到的透过液通过以钠滤膜为组件的超滤设备，调节温度为 25～30℃，压力为1.1～1.9MPa，流速为1.0～3.0L/h进行浓缩，得到浓缩液；

步骤四、用凝胶柱将步骤三得到的浓缩液进行凝胶过滤层析，收集洗脱液，得到棘白菌素B的粗品；

步骤五、将步骤四得到的棘白菌素B的粗品重结晶、加热回流和冷却干燥后，得到棘白菌素B的纯品。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)根据发酵液发酵产物种类多的特点，采用超滤分离、凝胶树脂分离和重结晶法，并在较低温度下进行，污染小，提取时间短，棘白菌素B损失少，蛋白质等杂质溶出较少，有效提高了棘白菌素B的得率，整个工艺提取率达到76％以上。

(2)利用钠滤，简单方便的消除了发酵以及纯化过程中产生的小分子杂质，有利于产品生产过程的提纯。

(3)在产品的分离纯化过程中用凝胶柱进行分离，进一步精确分离，得到了高纯度产品，纯度不低于98％。

方法二、一种发酵法合成棘白菌素B的方法，所述方法为：以构 巢曲霉为生产菌株，接种至发酵培养基中，分两个阶段进行培养，阶 段在30～37℃培养4～8天，随后第二阶段在23～27℃培养4～8天，将发酵 液分离纯化，获得棘白菌素B(ECB)；所述发酵培养基终浓度组成为： 甘油5～50g/L，蛋白胨5～50g/L，L-脯氨酸1～5g/L，甘露醇10～100 g/L，黄豆饼粉10～100g/L，鸟氨酸1～5g/L，花生油5～50g/L， K₂HPO₄·3H₂O₂～20g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然，优选发酵培养基终 浓度组成为：甘油1％，蛋白胨0.9％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇9.7％，黄豆饼粉4％，L-鸟氨酸0.5％，花生油2％，K₂HPO₄·3H₂O 0.84％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。本发明中培养基组成以质量体积(w/v)百分比表示，某组分浓度1％即表示100mL培养基中含有该组分1g。

主要参考资料

[1] CN201610023776.4棘白菌素B的提取纯化方法

[2] CN201610544096.7 一种发酵法合成棘白菌素B的方法