人髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞质抗体IGG(MPO-ANCA IGG)ELISA试剂盒的实验原理

基本信息^[1]

英文名称：Human Mouse myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody IgG,MPO-ANCA IgG ELISA kit

保存条件：2-8℃

用 途：用于定量检测血清、血浆及相关液体样本中人髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞质抗体IgG（MPO-ANCA IgG）的含量。

特点：灵敏性高、特异性强、重复性好

试剂盒种属：羊、鸡、鸭、鱼、人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、裸鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛等动植物。

实验原理^[1]

人髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞质抗体IGG(MPO-ANCA IGG)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人髓磷脂碱性蛋白(MBP)水平。用纯化的人髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入髓磷脂碱性蛋白(MBP)，再与HRP标记的髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的髓磷脂碱性蛋白(MBP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人髓磷脂碱性蛋白(MBP)浓度。

操作步骤^[1]

1.  加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 温育：操作同3。

7. 洗涤：操作同5。

8. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 

9.  加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

主要参考文献

[1] 孙晓菁 ， 陈旻 ， 赵明辉。 Rho GTP酶参与S1P诱导的MPO-ANCA阳性IgG介导的人肾小球内皮细胞的活化。第十三届全国免疫学学术大会。