标准绵羊血清(碳吸附过滤)的应用

背景^[1-5]

标准绵羊血清(碳吸附过滤)是绵羊血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。

标准绵羊血清(碳吸附过滤)经无菌采集、批量混合，最终过3次0．1um过滤分装而成在经过生物碳吸附补体等有害物质。标准绵羊血清(碳吸附过滤)适合于单抗研制、较常规的原代和传代细胞培养、规模化培养的疫苗生产。

碳吸附型血清是一款低水平类固醇类的血清产品，通过碳吸附可降低血清中许多激素及生长因子的浓度，如雌二醇、皮质醇、皮质酮、B类维生素、T3、T4、前列腺素等，该血清适用于上述一些分子可能干扰实验结果的实验中对于那些需要这些分子的细胞培养，可能降低细胞生长性能。

标准绵羊血清（碳吸附过滤）的解冻：

将血清从冰冻区中取出后（切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀），先置于2～8℃区域中使之融化，然后在室温下使之全融。使用前再预温到将使用的温度（如37℃），但必须注意的是，解冻过程中应轻轻地摇晃均匀。血清在解冻过程中可能会出现少量絮状或片状析出物，主要是血清中脂蛋白的变性或是纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）析出，但这些析出物，并不影响血清本身的质量。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

应用^[6][7]

标准绵羊血清(碳吸附过滤)可用于绵羊胚胎干细胞分离、培养、鉴定及诱导分化的研究

以内蒙古优势畜种绵羊为研究对象，建立并优化了其类胚胎干细胞的体外分离、培养体系，对获得的绵羊类胚胎干细胞进行了鉴定，并对其进行了系统的诱导分化研究，主要结果如下：

1.建立并优化了绵羊卵母细胞体外受精发育培养体系。添加10%～15%ESS、10μg/mL FSH、20μg/mL LH、1.5μg/mL17-βE2、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的TCM-199培养液能较好地促进绵羊卵母细胞体外成熟。绵羊卵母细胞体外成熟培养22～24h，用附睾精液进行体外受精，用Sofaa，10%FBS高糖Sofaa组合或CM，BM组合的发育液培养，置于38.5℃、三气(5%CO2、5%O2、90%N2)、饱和湿度的条件下，可获得较高的卵裂率(76.0%)和囊胚率(31.1%)。

2. 建立了绵羊类ES细胞的分离体系。SEF、MEF及两者的1:1混合细胞都可较好地支持绵羊类ES细胞的生长。在不具备获得体内胚的条件下，体外受精胚可替代体内胚用于类ES细胞的分离，同样也具有较好的增殖及传代能力。囊胚的质量和胚龄影响绵羊类ES细胞的贴壁及增殖。机械切割（半胚法）处理囊胚，可获得跟免疫法相近的ICM贴壁率（46%VS53.6%）。

3. 建立了绵羊类ES细胞的培养体系，获得的类ES细胞体外培养传代达到了20代。机械法结合酶消化法适合于绵羊类ES细胞的分离与传代。添加一定浓度的FBS、细胞生长因子、胰岛素及VC的DMEM高糖培养液可促进类ES细胞的增殖，适于绵羊类ES细胞的培养。培养获得的绵羊类ES细胞，具有ES细胞的典型特征，AKP染色呈阳性，表达Kit、Rex1、Sox2、Nanog和Oct4基因，OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81特异性蛋白，染色体倍性正常（2n=54），在体外可自发分化为囊状体及各胚层的细胞，具有ES细胞的自我更新和分化特性。

4.建立了绵羊类ES细胞体外分化培养体系。在诱导液中添加一定浓度的维甲酸或维甲酸与bFGF、Insulin联合使用，可将绵羊类ES细胞诱导分化为神经细胞，表达神经细胞特异性基因和蛋白（β-TubulinⅢ和Nestin）；添加β-甘油磷酸钠、DEX及VC盐的诱导液，可将绵羊类ES细胞诱导分化为成骨细胞，经AKP、茜素红和Kossa染色为阳性。添加DMSO或DMSO与RA联合使用的诱导液，可将绵羊类ES细胞诱导分化为心肌样细胞，其表达心肌特异性基因NKX2.5和GATA4及特异性蛋白α-Actin；脂肪细胞诱导液可促使绵羊类ES细胞分化为脂肪细胞，油红染色为阳性；添加一定浓度的ITS、EGF和NA的诱导液，可促使绵羊类ES细胞分化为胰岛分泌细胞，且表达特异性基因Insulin和PAX4及特异性蛋白Insulin。即绵羊类ES可诱导分化为来自于三个胚层的细胞。

参考文献

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[7]刘春霞.绵羊胚胎干细胞分离、培养、鉴定及诱导分化的研究[D].内蒙古农业大学,2013.