微囊藻毒素YR的制备方法

发布日期:2020/10/21 8:45:43

背景及概述^[1-2]

微囊藻毒素是一类具有生物活性的七肽单环肝毒素。由于多肽中两种可变氨基酸组成的不同，具有多种异构体。其中存在最普遍、含量最多的是微囊藻毒素LR，微囊藻毒素RR，微囊藻毒素YR这3种微囊藻毒素(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。具有水溶性和耐热性，加热煮沸都不能将毒素破坏；自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能将其完全去除。易溶于水、甲醇或丙酮，不挥发，抗pH变化，化学性质相当稳定，自然降解过程十分缓慢。世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0μg/L，《生活饮用水卫生标准》(GB5749—2006)将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1.0μg/L。水中微囊藻毒素可采用高效液相色谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定。

制备^[3]

一种微囊藻毒素分离纯化的方法，将有毒蓝藻水华干粉用乙酸水溶液为提取剂，采用经济的大孔吸附树脂D101作为分离纯化材料，通过两次过大孔吸附树脂层析柱分离，洗脱液为不同浓度的乙醇-水溶液，得到微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素YR和微囊藻毒素-LR的乙醇水溶液；步骤为：

A.称取有毒蓝藻水华干粉，加入其重量20-30倍的5％的乙酸溶液，连续搅拌40-50min，用6000g离心10min，取上清液；沉淀按上述提取步骤重复提取一次，合并两次提取上清，用0.45微米的滤膜过滤后旋转蒸发，得微囊藻毒素乙酸提取浓缩液备用，浓缩液的重量为原料蓝藻水华干粉重量的6-10倍；

B.大孔吸附树脂D101层析柱，10×100cm，酒精浸泡树脂24h后，依次用4％HCl、2％HCl各浸泡3-5h，去离子水洗成中性，将A步骤中的提取浓缩液调pH2.8-3.2后过柱，然后依次用为提取浓缩液一半体积的水、一半体积的15％乙醇淋洗，再依次用与提取浓缩液等体积的30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇洗脱，收集洗脱液；

C.将步骤B中获得的30％乙醇洗脱液旋转蒸发去乙醇后，再用上述同样条件新处理的大孔吸附树脂进行分离，过柱，然后用与步骤B同样体积的15％乙醇淋洗，再用30％乙醇洗脱，分段收集洗脱液；用HPLC-UV/MS法测定，得到含微囊藻毒素-RR乙醇水溶液；

D.将步骤B中获得的40％和50％乙醇洗脱液合并，旋转蒸发去乙醇后，再用上述同样条件新处理的大孔吸附树脂进行分离，过柱，然后用与步骤B同样体积的15％乙醇淋洗，再用40％乙醇洗脱，分段收集洗脱液；用HPLC-UV/MS法测定，分别得到微囊藻毒素YR乙醇水溶液和微囊藻毒素-LR乙醇水溶液；

E.微囊藻毒素的纯度检测采用HPLC-UV/MS法测定，色谱柱：SymmetryC18柱，2.1×150mm，3.0μm，柱温30.0℃；流动相：乙腈-水-甲酸，体积比依次为30∶70∶0.1；流速：0.3ml/min；紫外-检测器：238nm；液相色谱进样体积：10μL；质谱条件：采用正电子电离方式，喷雾电压3.7KV，脱溶温度：300℃，离子源温度：120℃，离子能量：1.0v，锥孔电压：30-60V，扫描范围：m/z＝400-1200；色谱峰面积归一化法计算微囊藻毒素纯度；由质谱信号判定色谱峰已基本分离。两次过大孔吸附树脂层析柱分离得到纯度≥80％的微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素YR和微囊藻毒素-LR的乙醇水溶液。