降纤酶的药理作用及应用

背景及概述^[1]

降纤酶是从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提纯的、具有单一成分的蛋白水解酶。能够抑制血小板聚集，降低血管阻力，增强红细胞变形能力，改善微循环。临床上用于治疗急性脑梗死、不稳定型心绞痛、静脉血栓、高粘血症等取得了较好的疗效。降纤酶可诱发组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)释放，并可增强t-PA促进纤维蛋白酶生成。降低α2纤溶酶原抑制物和纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物的活性。增强活性纤维蛋白溶酶活性，降解纤维蛋白原，缩短优球蛋白的溶解时间。还具有降低全血粘度，抑制红细胞沉降，增强红细胞血管通透性及变形能力，降低血管阻力，抑制血栓形成等作用。。

生化性质^[2]

国内从上世纪80年代起就开始了对蛇毒类凝血酶的研究。随着蛇毒类凝血酶临床应用及研究价值的明朗化，对尖吻腹蛇和长白白眉腹蛇蛇毒中类凝血酶的理化及酶学性质也进行了很多的研究。各种研究表明，尖吻腹蛇和白眉腹蛇都是TLE含量比较丰富的蛇种，其中尖吻腹蛇蛇毒中含有数种具有类凝血酶作用的同功酶。文献报道其分子量及等电点也不尽相同，造成这一现象的原因一方面可能是文献报道的分子量都是采用SDS-PAGE测定的，样品纯度的不一致及测定本身的误差导致的，另一方面也可能是不同地理环境及摄取食物的变化引起的生物差异如糖基化程度的不同导致的。

降纤酶是一种典型的类凝血酶，是以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，能高选择性的作用于血纤蛋白原，但其对血纤蛋白原的作用比凝血酶更为专一。凝血酶能先使血纤蛋白原α链N端16肽(FPA)裂解，从而使血纤蛋白首尾相连，接着再使β链N端14肽(FPB)裂解，血纤蛋白就进一步侧向聚合，体内凝血因子ⅩⅢ再使血纤蛋白分子间以肽键的形式交联，从而形成不可溶的血纤蛋白。而大多数蛇毒类凝血酶只作用于血纤蛋白原的一条链，仅有少数蛇毒类凝血酶能对两条链起作用。根据其对血纤蛋白原的作用方式可分为FPA型、FPB型和FPAB型。两种原料来源的降纤酶的酶学特征相似，它们都是典型的FPA型类凝血酶，具有FPA型类凝血酶的典型酶学特征：直接作用于纤维蛋白原α链N端的Arg16-Gly

键释放出血纤肽A(FPA)，生成非交联的纤维蛋白；不激活凝血因子Ⅱ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ，≫，ⅩⅢ；生成的纤维蛋白为可溶性的非交联单体；同时蛇毒类凝血酶能激活纤溶酶系统，因生成的纤维蛋白很快被清除；除了对纤维蛋白原的作用外，降纤酶还具有水解对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)和N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的活力，它的酶活力能被二异丙基氟磷酸(DFP)抑制，这也显示了其作为一种丝氨酸蛋白酶的本质。此外，与凝血酶不同的是，降纤酶不受肝素、抗凝血酶Ⅲ的影响，对于胰蛋白酶及凝血活性中心His的专一抑制剂甲苯磺酰氯甲酮(TLCK)以及金属蛋白酶抑制剂二乙胺基四乙酸(EDTA)无影响。对热比较稳定，早期的研究表明尖吻蝮蛇毒在60℃，pH值7.8的条件下加热10min，其类凝血酶样作用仅下降约10%。亦有文献报道，来自于尖吻腹蛇的降纤酶有微弱的促血小板凝集作用，其作用的强度约为凝血酶的万分之一。

降纤酶的结构研究^[2]

降纤酶结构的研究对于了解其对底物的选择性、结构与生物活性之间的关系以及利用基因重组技术进行表达等诸多研究领域具有关键意义。现阶段，降纤酶结构研究包括氨基酸序列的测定、二硫键位置及糖基化位点的确定、酶活性中心的推定及高级结构的模拟等。国内学者对国家药品标准规定的两种用于生产注射用降纤酶的原料来源尖吻腹蛇Agkistrodonacutus和长白山白眉蝮蛇中降纤酶的结构进行了研究。1997年，1999年，从尖吻腹蛇Agkistrodonacutus毒腺中制备总RNA，经PCR扩增后双向测序，并推导出其中尖吻腹蛇降纤酶acutin的相应的氨基酸顺序。实验结果表明acutin由233个氨基酸组成并且其氨基酸序列与腹亚科蛇毒类凝血酶的序列结构具有高度的同源性，基于同源性推导出其活性中心为His41，Asp84和Ser179，六对二硫键为：Cys7-Cys139，Cys26-Cys42，Cys74-Cys231，Cys118-Cys185，Cys150-Cys164，Cys175-Cys200。2002年报道了通过RT-PCR反应，从长白山白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussurensis)毒腺总RNA中克隆得到长白山白眉蝮蛇降纤酶gussurobin的cDNA，双向测序得到gussurobin基因的全序列并由此推测出相应的氨基酸序列。基于同源性推导出活性中心为His67，Asp112，Asp200和Ser206，六对二硫键为：Cys31-Cys165，Cys52-Cys65，Cys100-Cys258，Cys144-Cys212，Cys176-Cys191，Cys202-Cys237。与其他绝大多数类凝血酶一样，降纤酶是一种糖蛋白。有许多研究表明，糖蛋白中的糖基对其生物活性的保持、分子间识别及稳定性、抗原性具有重要影响。但迄今为止，对各种类凝血酶包括国产降纤酶的糖基部分的研究仅限于糖基化程度的确定及可能糖基化位点的推测。对其糖链部分的结构与作用的研究尚未见报道。

制剂规格与pH值^[3]

注射液：2mL∶20u；粉针剂：每支5u，10u。pH：4.8～6。

药理作用及应用^[3]

为我国长白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的毒液分离出的丝氨酸蛋白酶(SerineProtease)，此酶可降低血浆中的凝血因子Ⅰ的含量、抗血小板聚集与降低血液黏滞度，虽可使凝血因子Ⅰ的α链释放A纤维蛋白肽，但此肽很容易被酶水解而清除，而凝血因子Ⅰ降低是抗凝的主要效应；降纤酶还使纤酶原转化为纤溶酶，使血液黏滞度下降，抑制红细胞与血小板聚集，改善微循环，并使血栓溶解。临床用于治疗血栓闭塞型脉管炎、动脉栓塞、脑栓塞、一过性脑缺血发作(TIA)，心绞痛与心肌梗死的防治，消除血液高凝、高黏滞状态。对内耳血循环障碍引起的突发性耳聋亦有疗效。

用法用量^[3]

本品仅供静滴给药。成人量：急性期一日1次，每次10u，共3～4d；非急性期首剂10u，以后5～10u，24～48h1次，14d为1个疗程。

适宜溶剂^[3]

0.9%氯化钠注射液250～500mL。

给药速度^[3]

10u/250mL在60～90min滴完。滴速过快可致心悸。胸痛。

稳定性^[3]

注射液在5℃以下保存，勿冷冻；粉针剂在10℃以下保存，避光，密封。静滴溶液配制后即时使用，勿在室温下久置，以免活性降低。

不良反应^[3]

过敏性反应如瘙痒、荨麻疹、恶寒或发热甚至休克，出血反应可见瘀斑、鼻出血、牙龈出血，较轻微反应有头晕、头痛、一过性转氨酶升高。

禁忌/慎用证^[3]

对本品过敏、肝肾功能严重不全、心源性休克、心脏乳头肌断裂、心室中隔穿孔、多脏器功能衰竭、出血倾向、出血病史、术后伤口未完全愈合者禁用。70岁以上老年人、脑血栓后遗症、过敏性体质者慎用。用药期间暂停哺乳。溃疡病患者、孕妇及儿童慎用。

药物相互作用^[3]

与抗凝药、阿司匹林等非甾体镇痛药合用可加剧出血风险；抗纤溶药如氨基己酸、氨甲苯酸、止血环酸等拮抗本品的作用，不应合用。

注意事项^[3]

①发生过敏、出血时立即停药处理。②用药期间避免做深部穿刺与手术。③对用药者进行凝血因子Ⅰ及出、凝血功能检查，控制抗凝强度。

制备^[2]

蛇毒粗毒中成分非常复杂，除类凝血酶外还含有神经毒素、细胞毒素、肌肉毒素等许多活性成分，现行降纤酶质量标准要求降纤酶产品纯度达到SDS-PAGE电泳纯，HPLC测定纯度需大于90%。天然蛇毒中的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，经典的蛋白质提纯方法如盐析、热变性、酸碱变性、有机溶剂沉淀、超速离心等，由于专一性差和分辨率不高，已很少用于降纤酶的制备。只有少数的生产工艺会采用沉淀法作为初步分离的一种手段。从蛇毒粗毒中制备高纯度的类凝血酶，现在主要是以各种色谱分离技术为主。多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法纯化。常用的阴离子交换剂有：DEAE-葡聚糖凝胶、DEAE-纤维素、肝素-葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶多用G-100，G-75作分离。从国内文献来看，早期提纯降纤酶的方法大多用DEAE Sephadex离子交换层析加上凝胶过滤法，要得到纯度符合要求的单组分降纤酶一般都需要多步层析和过滤。近年来，随着亲和层析技术的发展成熟，作为一种高选择性的分离纯化技术，已被普遍地应用于蛇毒中降纤酶的分离与纯化。亲和层析用于从天然蛇毒中分离纯化降纤酶，主要运用的是酶与争剂特异性相互作用的原理。降纤酶的抑制剂有很多种，原则上说，这些抑制剂都可以作为特异性配基用于亲和层析。用胰蛋白酶的抑制剂Benzamidine作为类凝血酶的抑制剂，成功地将小分子物质用于亲和分离蛇岛蝮蛇毒类凝血酶，为类凝血酶亲和层析介质的发现和研究摸索了新的途径。总的说来，由于蛇毒粗毒中成分极其复杂，在降纤酶的实际生产制备中，大多数厂家均采用离子交换，凝胶过滤及亲和层析相互结合的分离纯化技术。就技术而言，分离得到纯度99.0%以上的高纯度降纤酶已不再是工艺难题。

主要参考资料

[1] 降纤酶的药理作用和临床应用

[2] 降纤酶研究进展

[3] 452种注射剂安全应用与配伍