降纤酶

蛇毒中蛋白质含量丰富，种类繁多，其含有的蛋白质几乎半数以上是具有各种催化活性的酶类，根据其作用主要分为神经毒类和出血毒类。这些酶无论在生物化学研究、生化药品开发以及临床应用等实践中，都具有重要的意义。作为蛇毒出血毒素中的一类，类凝血酶（thrombin-likeenzyme，简称TLE）是被研究得最多并且也是在临床应用最为成熟的蛇毒类生化药品。自1936年Klobusitz和Konig首次从矛头蝮蛇毒中获得部分纯 的类凝血酶以来，迄今已发现30余种蛇毒中含有近100种类凝血酶组分，并有40余种已得到分离和纯化，30余种的一级结构已得到确定，其中有一部分已经作为生化药品（如Ancrod，东菱克栓酶等）上市并广泛应用于临床。1997年，国家卫生部将以尖吻蝮蛇Agkistrodonacutus 和长白山白眉蝮蛇 Agkistrodonhaly sussuriensis蛇毒为原料提取的类凝血酶制品正式命名为降纤酶（Defibrase），制定并试行统一的质量标准（于2003年上升为国家药品标准）以规范其产品质量。 降纤酶是蛇毒类凝血酶制剂中的一种，具有去纤、降粘、解聚、溶栓等显著的抗凝作用，广泛地应用于临床治疗和预防闭塞性心脑血管血栓性疾病。
降纤酶为我国长白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的毒液分离出的丝氨酸蛋白酶（Serine Protease），此酶可降低血浆中的凝血因子I的含量、抗血小板聚集与降低血液黏滞度，虽可作用于凝血因子I的α链，使之释放出A肽（这与血液中的凝血酶相似），但不作用于β链，对凝血因子Ⅷ无作用，不会使纤维蛋白交联成不溶性凝块；此酶不作用于β链，对凝血因子Ⅷ无作用，不会使纤维蛋白交联成不溶性凝块，这种纤维蛋白不稳定，极易被血管内皮细胞释放的蛋白水解酶降解，从循环系统中清除。所以，本药极其重要的特点是通过降低血浆凝血因子I浓度，从而起到抗凝的作用，用药后，血浆凝血因子I浓度随剂量的增加而减少，但对血小板计数和功能、出血时间几乎无影响。降纤酶还使纤酶原转化为纤溶酶，使血液黏滞度下降，抑制红细胞与血小板聚集，改善微循环，并使血栓溶解。临床用于治疗血栓闭塞型脉管炎、动脉栓塞、脑栓塞、一过性脑缺血发作（TIA），心绞痛与心肌梗死的防治，消除血液高凝、高黏滞状态。对内耳血循环障碍引起的突发性耳聋亦有疗效。 同时，其还可用于治疗糖尿病、带状疱疹肾小球疾病、中风、突发性耳聋等，近几年来在治疗结肠癌等多种疾病中也得到广泛应用，且不良反应很少见。 从天然尖吻蝮蛇中提取的分子量为38kD的类凝血酶的 N 端15个氨基酸的序列为VIGGVECDIN EHRFL；从尖吻腹蛇Agkistrodon acutus毒腺中制备降纤酶acutin的相应的氨基酸顺序：由233个氨基酸组成，基于同源性推导出其活性中心为His41，Asp84和Ser179，六对二硫键为：Cys7-Cys139，Cys26-Cys42，Cys74- Cys231，Cys118- Cys185，Cys150- Cys164，Cys175- Cys200；从长白山白眉蝮蛇 毒腺总RNA中克隆得到长白山白眉蝮蛇降纤酶gussurobin的cDNA，双向测序得到其基因的全序列并由此推测出相应的氨基酸序列。基于同源性推导出活性中心为His67，Asp112，Asp200和Ser206，六对二硫键为：Cys31-Cys165，Cys52- Cys65，Cys100- Cys258，Cys144-Cys212，Cys176- Cys191，Cys202- Cys237；从天然长白山白眉腹蛇蛇毒中纯化分离出来的分子量约为38kD的类凝血酶进行N端测序，测得其N端序列为IIGGDECNIN EHRFL。 降纤酶是一种典型的类凝血酶，是以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，能高选择性的作用于血纤蛋白原，但其对血纤蛋白原的作用比凝血酶更为专一。根据其对血纤蛋白原的作用方式可分为FPA型、FPB 型和FPAB 型。两种原料来源的降纤酶的酶学特征相似，它们都是典型的 FPA 型类凝血酶，具有FPA 型类凝血酶的典型酶学特征：直接作用于纤维蛋白原α链 N 端的Arg16-Gly键释放出血纤肽A（F PA），生成非交联的纤维蛋白；不激活凝血因子II、V、VII、VIII、IX、X、XI、XIII；生成的纤维蛋白为可溶性的非交联单体；同时蛇毒类凝血酶能激活纤溶酶系统，因而生成的纤维蛋白很快被清除；除了对纤维蛋白原的作用外，降纤酶还具有水解对甲苯磺酰-L -精氨酸甲酯（TAME）和N-苯甲酰- L-精氨酸乙酯（BAEE）的活力，它的酶活力能被二异丙基氟磷酸（DFP）抑制，这也显示了其作为一种丝氨酸蛋白酶的本质。此外，与凝血酶不同的是，降纤酶不受肝素、抗凝血酶III的影响，对于胰蛋白酶及凝血活性中心 His的专一抑制剂甲苯磺酰氯甲酮（TLCK）以及金属蛋白酶抑制剂二乙胺基四乙酸（EDTA）无影响。对热比较稳定，早期的研究表明尖吻蝮蛇毒在 60℃，pH值7.8 的条件下加热10 min，其类凝血酶样作用仅下降约 10 %。亦有文献报道，来自于尖吻腹蛇的降纤酶有极微弱的促血小板凝集作用，其作用的强度约为凝血酶的万分之一。

图1为注射用降纤酶 降纤酶可诱发组织纤维蛋白溶酶原激活剂（t-PA）释放，并可增强 t-PA 促进纤维蛋白酶生成；减少纤维蛋白溶解酶原激活剂抑制因子（PAI）的数量，并降低其活性；降低 α2 纤溶酶原抑制物和纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物的活性。增强活性纤维蛋白溶酶活性，降解纤维蛋白原，缩短优球蛋白的溶解时间。还具有降低全血粘度，抑制红细胞沉降，增强红细胞血管通透性及变形能力，降低血管阻力，降低全血黏度，抑制红细胞凝集，使血管阻力下降，改善微循环，使红细胞通过时间缩短，起到疏通血管、溶解血栓的作用。 方法1:
1）取蛇毒粗品 16g，用 EDTA 络合-硫氰酸钾沉淀法初步分离类凝血酶，在上层析柱前先将出血毒去除，并去除一部分非类凝血酶成分；
2）用 DEAE- Sepharose Fast Flow 快速柱层析，pH 8.0 的0.05mol/L Tris-HCl 平衡。由1）得到的蛇毒溶液透析脱盐，上述缓冲液平衡，上柱并进行梯度洗脱。洗脱条件混合筒为 pH 8.0 的0.05 mol/L Tris-HCl 2000 ml作起始缓冲液，贮存筒为含 0.4 mol/L氯化钠的上述起始缓冲液。测定洗脱液在波长 280 nm 处的吸光度 A，以A为纵坐标，管数为横坐标绘制层析图，测定各峰类凝血酶活性及分子量分布，取与降纤酶性质相同的洗脱组分行下一步纯化；
3）用 SephadexG-75 prepgrad 柱层析，无热原蒸馏水平衡，取上述2）所得组分，浓缩后上柱，无热原蒸馏水洗脱，测定洗脱液 280 nm处A，绘制层析图。逐管检测凝血活性，将具有凝血活性的组分每3管合并，取样作 SDS-PAGE，合并收集单一区带（相对分子质量Mr为36000）组分，即为纯化的降纤酶。
方法2:
1）取 DEAE SephadexA-50，加入新鲜蒸馏水，加热煮沸15min，放至室温， 加 pH 7.6 的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液搅拌，放置数小时，弃去上清液，再加入上述缓冲液，如此反复数次，测 pH为7.6，即达平衡。用上述缓冲液平衡，是因为降纤酶的最适 pH 为 7.4～7.6，且在pH 7.6 条件下，DEAE-SephadexA- 50 稳定 。
2）蛇毒粗品均匀加在 DEAE-SephadexA-50 柱中。 洗脱条件，第一梯度，在搅拌瓶中加 pH7.6，0.1mol/L 氯化钠的Tris 缓冲液1000 ml；第二梯度，在搅拌瓶中加 pH 7.6，0.1 mol/L 氯化钠的Tris 缓冲液 1000 ml，贮存瓶中加pH7.6，0.1 mol/L 氯化钠的Tris缓冲液1000 ml。共分离出 9个峰，将合格峰合并，即得。 1. 用于四肢血管病（如血栓闭塞性脉管炎、雷诺综合征、股动脉栓塞）、脑血管病（如短暂性脑缺血发作、脑栓塞、脑梗死），还可用于肺栓塞。
2. 用于心肌梗死，还可用于预防心肌梗死及不稳定型心绞痛再复发。
3. 用于血液高黏状态、高凝状态、血栓前状态。
有关降纤酶的概述、结构、特征及分类、药理作用、制备方法、不良反应等是由Chemicalbook的旭艳编辑整理。（2016-05-10） 注射液在5℃以下保存，勿冷冻;粉针剂在10℃以下保存，避光，密封。静滴溶液配制后即时使用，勿在室温下久置，以免活性降低。 不良反应多为轻度，主要为注射部位出血、创面出血、头痛、头晕、耳鸣，偶有轻度皮下瘀斑、鼻衄、恶心、呕吐、上腹不适、皮疹、发热、血AST、ALT、BUN、Cr升高，尿潜血阳性，罕有引起休克的情况。
应仔细观察病情，发现异常时终止给药，并采取输血等妥当的措施。在医师指导下用药，定期检查血小板（每周1次），如血小板降至8×109/L 以下时需停药，恢复后再继续用药。用药3周为1个疗程，如需继续用药应间隔1周左右为宜，或根据病情连续用药。本品系蛋白酶制剂，用药前需做过敏试验，用生理盐水将本品稀释成0.001U/ml浓度，取0.1ml作皮试，15 分钟后观察，红晕直径不超过1cm，或伪足不超过三个者判为阴性，试验阴性时方可使用，用药过程中注意过敏反应，如遇有过敏反应时，应给脱敏药物治疗。
低纤维蛋白血症、脑出血2周内、活动性肺结核和溃疡病、重症高血压、亚急性细菌性心内膜炎、严重肝肾功能不全者禁用，月经期女性患者慎用。 使用本品应避免与水杨酸类药物（如阿司匹林）合用。抗凝血药可加强本品作用，引起意外出血；抗纤溶药可抵消本品作用，禁止联用。 1. 以下情况慎用：①对本品过敏或过敏体质者；②有消化性溃疡病史者；③70岁以上老年患者；④有脑血栓后遗症者。
2. 静脉滴注时，应注意控制滴速（如速度过快，患者可出现胸痛、心悸等不适症状），宜持续滴注1小时以上。
3. 动脉或深部静脉损伤患者用药后可能引起血肿，故临床应避免进行如星状神经节封闭、动脉或深部静脉等的穿刺检查或治疗。对浅表静脉穿刺部位有止血延缓现象发生时，应采用压迫止血法。 1. 对本药过敏者。
2. 正在使用其他纤维蛋白溶解药、抗凝药或抗血小板药的患者。
3. 严重肝、肾功能不全者。
4. 乳头肌断裂、心室中隔穿孔、心源性休克或其他多脏器功能衰竭者。
5. 有出血倾向或出血疾病史者。
6. 术后不久的患者。