凝血酶-特异性凝血系统蛋白与癌症和转移多方面的影响

1、背景介绍

癌症传播是一种多步骤过程，其中自然地转移肿瘤细胞遇到许多障碍。原发性肿瘤从血管内分离，在血管中存活，克服血液的机械流动和免疫系统组分，跨内皮迁移，远端血管床内的稳定，生长以及建立新的支持性脉管系统是肿瘤细胞必须面对的有效转移的主要挑战。几乎每一个恶性细胞的移动都伴随着凝血酶的一些功能参与，凝血酶是癌症扩散的主要参与者，其可以直接通过其受体（蛋白酶激活受体，PAR）或间接通过产生纤维蛋白基质来修饰肿瘤细胞行为。凝血酶可局部增强肿瘤侵袭性潜能，有助于癌细胞迁移和播种。前血栓形成状态是晚期和转移性癌症的特征。

2、凝血酶和血液凝固

凝血酶是十九世纪发现的多效性酶。它属于丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶家族，其独特的结构决定了大量底物的特异性识别。凝血酶的特异性取决于三个位点之间的竞争：活动位点和外显I和II 。直接或辅助因子介导的外部位置相互作用影响初始凝血酶 - 底物复合物，使得肽键的切割可以进行。凝血酶起着两个重要的相反作用， 它即可作为促凝血因子将可溶性纤维蛋白原转变成损伤部位的不溶性纤维蛋白凝块，又可作为蛋白C活化的抗凝血剂（图1）。 纤维蛋白凝块通过转谷氨酰胺酶因子XIII的活化，通过激活Tis-sue因子途径抑制剂（TAFI）的纤维蛋白溶解的抑制和因子V，VIII和XI的蛋白水解活化来稳定。凝血酶与跨膜糖蛋白结合，内皮细胞表达的血栓调节蛋白（TM）抑制其分裂纤维蛋白原的能力。与TM结合的凝血酶也激活了通过特异性内皮细胞的蛋白C受体（EPCR）而进一步增加的蛋白C（PC）。活化蛋白C（APC）使凝血酶产生所需的凝血因子：Va和VIIIa，Xa和IXa失活。 凝血酶最终在活性部位被阻断，并通过循环血清蛋白，如抗凝血酶（AT）和凝血酶特异性肝素辅因子II（HCII）循环清除。

3、原发肿瘤-凝血酶与肿瘤细胞和肿瘤微环境的相互作用

 凝血酶由其酶原、凝血酶原产生，通过FVa和FXa以及带负电荷的磷脂的凝血酶原酶复合物在两个位点切割产生。蛋白酶、细胞因子和生物活性脂质被分泌到细胞外空间环境中，以自动或旁分泌的方式从癌细胞功能修饰肿瘤微环境，以适应入侵。外源凝血酶通过其PAR-1受体诱导肿瘤生长和血管生成，以及肿瘤细胞对血小板、EC、纤维蛋白和血管性血友病因子的粘附具有突出的证据，具有促进作用的累积结果转移。然而，在肿瘤生长和转移过程中，内源性凝血酶在宿主中产生的确切调节机制仍然很差。已知肿瘤能够产生内源性凝血酶，但血浆中肿瘤生成的凝血酶的浓度或肿瘤微环境是不确定的。这是一个重要的问题，因为凝血酶对肿瘤生长的影响是双相解决的，其浓度为0.5 U / mL时发生激活，而在较高的浓度下可见抑制。

4、循环肿瘤细胞（CTCs）凝血酶介导的血管生存和停滞

从原发性肿瘤脱落并进入血液循环的肿瘤细胞称为CTCs。在渗透后，CTCs遇到潜在的障碍，包括物理反对肿瘤细胞锚定的机械剪切力，以及由于细胞粘附丧失引起的程序性细胞死亡的脱落凋亡。肿瘤细胞已发展出防御机制来对抗这些顽固性疾病。 EMT对于有效传播是必不可少的，因为它促进了血液中CTCs的存活，而在血液中以及通过间质与上皮转换或MET逆转过程的循环系统外循环。有证据表明，EMT也降低了癌细胞对化疗和靶向治疗的敏感性。虽然在上皮和间质表型之间转换，细胞可以获得混合上皮（粘附）、间质（迁移）表型，其允许CTCs作为受保护的簇在血液中移动而不被破坏（图2）。有证据表明，这样的簇更具抗细胞凋亡，更能有效地离开血液，并且具有比单独迁移的CTCs更多的肿瘤起始潜力。

凝血酶介导的整联蛋白激活与MMP-9，MMP-2和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达促进CTCs与血小板，白细胞和EC的粘附相互作用，改善CTCs在血液中的存活 ，并且在流动条件和随后的外渗情况下在微血管中促进其停滞（图3）。 由于凝血酶活性，肿瘤细胞和其他分子之间的粘附事件由纤维蛋白原转录支持到纤维蛋白。

5、循环肿瘤细胞（CTCs）-凝血酶介导的外渗

5.1血小板、肿瘤细胞、 EC相互作用

血小板、肿瘤细胞栓塞有助于通过促进其与EC的粘附来阻止CTCs的流行。从那里，他们随后从血管空间迁移到血管周围的空间。 HELA和HT29肿瘤细胞在血小板存在时，与单独使用相比，在培养物中具有更高亲和力的ECs。霍奇金淋巴瘤细胞系通过与凝血酶激活的血小板接触诱导后以CD15和P-选择素依赖性方式结合HUVEC。恶性细胞经内皮细胞迁移的途径有两种：即通过细胞 - 细胞连接和跨细胞（即通过个体EC，内皮肌球蛋白II功能）。虽然在乳腺癌中描述了外渗的多细胞途径，但没有关于凝血酶在该机制中起作用的数据。相比之下，有证据表明凝血酶参与癌细胞传播的细胞旁路径。

5.2 VE-钙粘蛋白复合物

血管内皮间隙形成由两个相互关联的过程组成，即VE-钙粘蛋白复合物完整性的丧失和由肌动球蛋白机制引起的内皮膜的吸收。肿瘤细胞对EC的粘附起始于钙粘蛋白、连环蛋白复合物的修饰，导致内皮屏障的细胞旁通透性增加。最近对黑素瘤细胞的实验证实，肿瘤细胞可以通过介导凝血酶依赖性连接蛋白的凝血酶依赖性瞬变和局灶重组来遵循白细胞TEM的范例。负责维持内皮的粘附连接（AJ）  是由跨膜血管内皮钙粘蛋白（VEC）和细胞质连环蛋白（p120，β-连环蛋白，血红蛋白，α-连环蛋白）组成的多蛋白复合物（图4）。

6、转移区域

在原发性肿瘤远端的器官中，MET的表型转换机制使CTCs能够生长和定植，从而增强了建立转移的可能性。扩张的四氯化碳失去迁移能力恢复与其他细胞的紧密接触，最终促成生长。形成暂时性促血管生成基质，作为促凝血酶/ PAR / IP3 / Ca2 + / MAPK级联活化和后续细胞反应的内皮屏障功能障碍。凝血酶/ PAR依赖性途径导致血管生成因子（VEGF，VEGFR2，Ang-2）的上调，并伴随着增加的ECs屏障通透性有助于诱导新生远端组织中的继发性肿瘤的血管发生和接种。

概论

凝血酶似乎是癌症传播的主要参与者（图5），目前持续发现其对免疫功能和miR调控的新贡献。了解凝血酶对转移的分子机制有助于发展高效治疗和抗癌。

【参考文献】

Wojtukiewicz MZ,Hempel D, Sierko E, Tucker SC5, Honn KV.Thrombin-unique coagulation system protein with multifaceted impactson cancer andmetastasis.Cancer Metastasis Rev. 2016;35(2):213-233.