凝血酶的提取方法

背景及概述^[1][2]

凝血酶是一种使纤维蛋白原水解成为纤维蛋白的蛋白酶。凝血酶存在于动物血液中，通常以无活性的酶原形式存在。当组织受伤或血管有病变时，细胞及血小板释放凝血酶原激酶，使凝血酶原变为有活性的凝血酶。 主要生理功能是参与血液凝固。在血液中，凝血酶使可溶性的纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白，而血纤维蛋白经Ca²⁺和转酰酰胺酶作用即凝结成块，此即血液凝固。这种情况发生于组织创伤时，有止血作用;发生于血管病变时，易形成血栓。血栓在脑血管中则称脑血栓，可导致瘫痪;血栓在冠状动脉中导致部分心肌坏死(心肌梗死)。凝血酶还有刺激细胞增殖、诱导释放纤溶酶原激活物，促进溶解血栓作用以及促进脂蛋白代谢多种生理功能。

制备^[3]

凝血酶(Thrombin,EC3.4.21.5)是血浆凝血系统中的一种具有高度特异性的丝氨酸蛋白水解酶，可作为局部止血药，是凝血酶冻干粉的主要原料。凝血 酶可以水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体，促使血小板分泌和聚集，因此，凝血酶在血液凝固和止血过程中发挥着重要的作用。

在临床上，凝血酶广泛应用 于局部止血，可用于手术中不易结扎的小血管止血，消化道出血以及外伤出血等。凝血酶能识别LeuValProArg↓GlySer氨基酸序列，因此凝血酶在基因工程 中所得到的融合蛋白产品的后序加工处理过程中具有独特的作用，为达到子目 的，必须使用限制性的凝血酶。现有技术制备方法一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和冻干(或制剂)。

公开号为CN1844380A的发明专利提出了一种制备高纯度凝血酶的方法，该方法利用层析介质吸附低纯度凝血酶溶液，对层析 柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，再经凝胶层析，超滤脱盐浓缩，最后冻干得 限制性凝血酶成品。该专利申请涉及到利用凝胶层析，不容易实现工业化生产， 且仅用到比活一个参数，不足以说明凝血酶的纯度。

一种纯度高、比活高的限制性凝血酶的制备方法。包括如下步骤：

步骤1、向新鲜猪血中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；

步骤2、将上清抗凝血浆用阴离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅰ对阴离子交 换柱进行洗脱，所得洗脱液即为凝血酶原溶液；

步骤3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；

步骤4、将凝血酶粗溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；

步骤5、将所得的凝血酶浓缩液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅱ对阳 离子交换柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得初步纯化的凝血酶溶液；

步骤6、将步骤5所得凝血酶溶液用平衡液进行透析；

步骤7、将步骤6所得凝血酶溶液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅲ对 阳离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为限制性凝血酶溶液；

步骤8、将限制性凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得限制性凝血酶浓缩液；

步骤9、将限制性凝血酶浓缩液冻干，即得白色粉末状限制性凝血酶成品。

本发明的有益效果在于：利用猪血制备限制性凝血酶，有利于充分利用猪 血资源，减少环境污染；在常温常压下即可制备限制性凝血酶，减少设备投资； 制备得到的限制性凝血酶纯度高，可达到电泳纯，可用于酶切GST融合蛋白； 操作简单，仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生 产。

提取方法^[4]

一种从猪血中提取凝血酶的方法，包括如下步骤：

(1)往猪血中加入柠檬酸三钠溶液，将混合液离心至分层后收集上清液，上清液用双层脱脂纱布过滤后得上清抗凝血浆；

(2)将步骤(1)所得的上清抗凝血浆用A-50层析柱进行层析，上清抗凝血浆中的凝血酶原被吸附于A-50层析柱上，用氯化钠溶液Ⅰ洗涤A-50层析柱，随后用氯化钠-氯化钙混合溶 液洗脱并激活吸附于A-50层析柱上的凝血酶，得到凝血酶粗提液；

(3)将步骤(2)所得的凝血酶粗提液用树脂层析柱进行层析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于树脂层析柱上，用氯化钠溶液Ⅱ洗脱吸附于树脂层析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；

(4)将步骤(3)所得的凝血酶精提液去除病毒后进行脱盐浓缩，得凝血酶浓缩液；

(5)将步骤(4)所得的凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。

主要参考资料

[1] 兽医大辞典

[2] 科学技术社会辞典·生物

[3] CN201610107662.8 限制性凝血酶的制备方法

[4] CN201711147689.0 一种从猪血中提取凝血酶的方法